本文關(guān)鍵詞：PDCD4在腦缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：目的：缺血性腦血管病已經(jīng)成為嚴(yán)重影響我國中老年人健康的常見疾病,并有逐年遞增的趨勢,目前臨床的治療措施主要是溶栓和介入。這些治療一方面可使缺血的腦組織及時(shí)得到再通,恢復(fù)腦組織功能,但另一方面部分患者腦功能不僅沒能恢復(fù),反而出現(xiàn)病情進(jìn)一步加重,此即缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion, I/R)損傷。I/R損傷的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜,對其防治具有很大困難,因此,找到參與I/R損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)并用于缺血性腦血管病的治療,成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。程序性細(xì)胞死亡因子4 (Programmed Cell Death 4, PDCD4)作為一種抑癌基因,研究顯示它可直接與靶基因的mRNA編碼區(qū)域結(jié)合阻斷翻譯過程,或通過與真核細(xì)胞翻譯起始因子(Eukaryotic Translation Initiation Factor, elF) 4G競爭性結(jié)合eIF4A,抑制靶蛋白的翻譯起始,進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)化、侵襲及自噬等生物學(xué)行為；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)PDCD4可以促進(jìn)炎癥的發(fā)生,在腫瘤、肥胖、糖尿病和心血管等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,但是PDCD4在缺血性腦血管病中的作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)擬通過大腦中動(dòng)脈栓塞模型(Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO)和細(xì)胞的糖氧剝奪模型(Oxygen and Glucose Deprivation, OGD)從體內(nèi)和體外兩方面來深入研究PDCD4在缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制,找到參與I/R損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn),用于缺血性腦血管病的治療。方法：1.腦缺血再灌注損傷后PDCD4在小鼠腦中的作用及表達(dá)變化1.1將野生型(Wild Tipe, WT)小鼠和PDCD4-/-敲基因小鼠隨機(jī)分組,建立大腦中動(dòng)脈栓塞模型。在缺血2h后不同的再灌注時(shí)間點(diǎn)取材,利用神經(jīng)病學(xué)評分、TTC染色、HE染色、尼氏染色、TUNEL等方法驗(yàn)證PDCD4在腦缺血再灌注損傷中的生物學(xué)作用。1.2通過Western blot、免疫組織熒光雙標(biāo)檢測PDCD4在損傷后的分布及表達(dá)變化。2.探究PDCD4在腦缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制2.1通過TUNEL染色,Western blot檢測Bcl-2/Bax及caspase-3觀察神經(jīng)元凋亡的改變,從而驗(yàn)證PDCD4對腦缺血再灌注后凋亡水平的影響。2.2用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測缺血再灌注模型后PDCD4-/-小鼠及WT小鼠促炎因子IL-6, IL-1β, TNF-α,趨化因子MCP-1以及抑炎因子IL-10等細(xì)胞因子的變化,進(jìn)而探究PDCD4能否通過炎性反應(yīng)加重腦損傷。2.3利用透射電鏡觀察自噬小體形成及超微結(jié)構(gòu)變化,免疫熒光染色及Western blot等觀察自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beclin-1及Atg5等亞細(xì)胞定位及表達(dá)變化,以確定PDCD4對腦缺血再灌注損傷后自噬的調(diào)節(jié)。通過Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic Reticulum Stress, ERS)的關(guān)鍵分子BIP和CHOP,探究PDCD4對ERS介導(dǎo)的自噬的調(diào)控。3.糖氧剝奪(OGD)后PDCD4的表達(dá)變化及對下游通路的調(diào)控3.1本實(shí)驗(yàn)選用大鼠來源的神經(jīng)細(xì)胞株P(guān)C-12,小鼠來源的小膠質(zhì)細(xì)胞株BV-2為研究對象,轉(zhuǎn)染siRNA-PDCD4或pEFGP-PDCD4,分別基因沉默或過表達(dá)PDCD4,將轉(zhuǎn)染之后的細(xì)胞進(jìn)行OGD處理,在恢復(fù)糖氧之后的不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,免疫熒光和Western blot檢測PDCD4轉(zhuǎn)染效率,以及下游基因LC3B,p-ERK1/2, BIP, CHOP等的表達(dá)變化。3.2為了探究MAPK/ERK信號通路對ERS和自噬的作用,我們使用PC-12構(gòu)建OGD模型,在復(fù)糖復(fù)氧的同時(shí)添加MEK1/2抑制劑U0126,觀察阻斷MAPK/ERK信號通路后ERS和自噬的表達(dá)變化。在OGD條件下,取BV-2細(xì)胞用Real-time RT PCR法檢測相關(guān)炎性因子的表達(dá)變化,進(jìn)一步驗(yàn)證PDCD4在炎性方面對再灌注損傷的影響。結(jié)果：1. PDCD4的缺失對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用通過神經(jīng)學(xué)評分、TTC染色,我們發(fā)現(xiàn)在MCAO模型后,PDCD4-/-敲基因組與WT組相比神經(jīng)學(xué)評分顯著降低,腦損傷面積明顯減少；同時(shí)HE、Nissl和TUNEL染色結(jié)果進(jìn)一步證明,PDCD4缺失明顯降低腦缺血再灌注損傷。2.腦缺血再灌注損傷后PDCD4的表達(dá)先降低后升高2.1我們選取腦損傷后的缺血半暗帶(Ischemic Penumbra, IP)作為研究對象,通過Western blot結(jié)果分析,我們發(fā)現(xiàn)PDCD4在腦損傷后表達(dá)有所降低,其中在再灌6小時(shí)處達(dá)到最低值,24h有所恢復(fù),然后在48小時(shí)表達(dá)升高。2.2免疫組織熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示,PDCD4分布廣泛,在神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞中都有表達(dá),但是主要分布于神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞中,并且在細(xì)胞漿與細(xì)胞核中都存在PDCD4的表達(dá)。2.3體外實(shí)驗(yàn)過程,我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞系PC-12在做完OGD之后,PDCD4的表達(dá)與體內(nèi)的結(jié)果相一致,但是正常小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2中PDCD4的含量較低,OGD之后PDCD4表達(dá)不斷升高。3. PDCD4能夠顯著提高神經(jīng)細(xì)胞的凋亡水平TUNEL染色結(jié)果顯示,相對WT小鼠腦缺血模型,PDCD4-/-小鼠中細(xì)胞凋亡數(shù)顯著降低。Western blot分析結(jié)果顯示,在敲基因小鼠中Bcl-2/Bax及Cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)量也顯著降低。4. PDCD4通過促進(jìn)炎性反應(yīng)加重腦損傷4.1通過對炎癥指標(biāo)的檢測,我們發(fā)現(xiàn)在缺血再灌12h后,通過Real-timePCR,我們發(fā)現(xiàn)促炎因子IL-6, IL-1β, TNF-α和趨化因子MCP-1的表達(dá)都升高,但PDCD4-/-小鼠與WT小鼠相比,炎性因子的表達(dá)相對降低。4.2在體外實(shí)驗(yàn)中,通過基因沉默BV-2細(xì)胞中PDCD4,構(gòu)建OGD模型,通過Real-time PCR檢測上述炎性因子,發(fā)現(xiàn)相對于正常組,PDCD4沉默后炎性反應(yīng)降低,與體內(nèi)結(jié)果一致。5. PDCD4能夠抑制神經(jīng)元的自噬水平5.1通過透射電鏡對自噬的檢測,我們發(fā)現(xiàn)相對于WT小鼠,敲除小鼠的自噬小體有所升高；Western blot的結(jié)果顯示,LC3B的表達(dá)也是升高的,但是雖然在PDCD4-/-小鼠中自噬水平相對升高,但是Beclin-1的水平并沒有升高,而是Atg5以及Atg12-Atg5的相對表達(dá)量有所升高,體外實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。5.2通過WT小鼠與PDCD4-/-小鼠的Western blot結(jié)果分析,我們發(fā)現(xiàn)在敲除小鼠中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記蛋白BIP的表達(dá)升高,但是CHOP的表達(dá)并沒有升高,反而有降低的趨勢。體外沉默PDCD4之后,得到了相同的結(jié)果,而將PDCD4過表達(dá)之后,BIP降低,CHOP升高。5.3體內(nèi)與體外的Western blot結(jié)果顯示,在PDCD4基因缺失之后,p-ERK的表達(dá)升高,同時(shí)BIP與LC3B的表達(dá)也隨之升高,說明p-ERK參與了PDCD4對ERS和自噬的調(diào)控。5.4體外通過U0126抑制MAPK/ERK信號通路,我們發(fā)現(xiàn)BIP的表達(dá)量也受到抑制,而且LC3B的表達(dá)與BIP呈現(xiàn)一致性。結(jié)論：1. PDCD4能夠加重小鼠的腦缺血再灌注后損傷程度。2.在腦缺血再灌注損傷后,不同實(shí)質(zhì)細(xì)胞中PDCD4表達(dá)變化并不一致,其中神經(jīng)元中先降低后升高,小膠質(zhì)細(xì)胞中升高。3. PDCD4通過抑制ERK1/2通路抑制ERS及自噬,還可以通過促進(jìn)凋亡、炎癥反應(yīng)加重腦缺血再灌注損傷。
【關(guān)鍵詞】：腦缺血再灌注損傷 PDCD4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 自噬 炎癥
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-14
• 符號說明14-16
• 前言16-21
• 實(shí)驗(yàn)材料21-28
• 實(shí)驗(yàn)方法28-41
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-45
• 討論45-50
• 結(jié)論50-51
• 附圖51-60
• 附表60-62
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 致謝68-69
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文69-70
• 附件70

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