本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子EGR1對缺血性卒中預(yù)后的影響及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：卒中在全球范圍內(nèi)是致死和致殘的主要疾病之一。其中,缺血性腦卒中占所有腦卒中的87%,其高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率嚴(yán)重威脅著人類的生活質(zhì)量。缺血性卒中的基本病理改變是腦梗死。其發(fā)生機制是由于局部腦組織血流供應(yīng)障礙,導(dǎo)致缺血區(qū)組織壞死。供血發(fā)生障礙后,缺血區(qū)域的組織有兩種命運。其一是缺血核心區(qū)的組織因血流完全中斷、能量耗竭,很快引起組織不可逆性損傷(缺血壞死)和相應(yīng)腦功能的喪失；其二是缺血周圍區(qū),由于側(cè)支循環(huán)的存在導(dǎo)致其供血部分存在,若在短時間內(nèi)恢復(fù)血流,組織仍能被拯救,若血流不能恢復(fù),則組織最終也發(fā)生不可逆性損害,這部分區(qū)域被稱為缺血半暗帶。對于缺血半暗帶,葡萄糖和能量代謝障礙所引發(fā)的瀑布式級聯(lián)反應(yīng)和缺血再灌注后的病理變化是導(dǎo)致組織損傷的重要原因。在過去幾十年中,神經(jīng)科學(xué)界一直在探索急性卒中的治療方法,在細(xì)胞研究和動物研究中發(fā)現(xiàn)了不少有效的方法,包括抗氧自由基、抗興奮性氨基酸、神經(jīng)保護、干細(xì)胞移植等,然而,絕大多數(shù)研究結(jié)果都無法轉(zhuǎn)化到臨床實踐中。目前只有在相當(dāng)窄的時間窗內(nèi)給予組織纖溶酶原激活物(recombinant human tissue-type plasminogen activator, rtPA)溶栓這一治療獲得了充分的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。溶栓治療以藥物溶解血栓,從而使閉塞的血管恢復(fù)再通。雖然溶栓治療有確切的治療效果,但因其治療時間窗較窄,大部分患者難以在時窗內(nèi)抵達醫(yī)院而錯失了治療時機,另外,靜脈溶栓也有一定的出血風(fēng)險,這些不足限制了其在臨床上的廣泛開展。神經(jīng)營養(yǎng)素家族在神經(jīng)再生和重塑方面發(fā)揮著重要作用,主要包括神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)、腦源性神經(jīng)生長因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)素3(neurotrophin-3, NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)素4/5(neurotrophin-4/5, NT4/5)、神經(jīng)營養(yǎng)素6(neurotrophin-6, NT-6)和神經(jīng)營養(yǎng)素7(neurotrophin-7, NT-7)。研究發(fā)現(xiàn),這些可溶性多肽因子能抑制神經(jīng)元凋亡,促進神經(jīng)元存活、再生、塑形和與神經(jīng)相關(guān)酶的合成。BDNF是腦內(nèi)最重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一,具有維持、調(diào)控以及促進神經(jīng)細(xì)胞生長的作用,能對各類神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮作用。BDNF分布于腦內(nèi)廣泛區(qū)域,在外周組織中也有一定分布。動物實驗證實,BDNF可降低缺血性卒中后局部腦組織缺血的程度,促進神經(jīng)功能恢復(fù),減輕神經(jīng)功能缺損程度。這些作用與BDNF促進神經(jīng)分化、神經(jīng)再生和神經(jīng)重塑等作用有關(guān)。但目前BDNF的這些作用只限于細(xì)胞和動物研究中,并未在臨床實踐中獲得明確療效。早期生長反應(yīng)因子(early growth response 1, EGR1)也被稱為神經(jīng)生長因子可誘導(dǎo)因子(nerve growth factor inducible factor, NGFI-A)、Zif268、Krox-24及Tis8。EGR1具有三個高度保守的鋅指結(jié)構(gòu),能夠與靶基因DNA序列中富含GC的區(qū)域結(jié)合。目前認(rèn)為與EGR1結(jié)合的DNA序列是G(C/A)GGGGG(C/A)GGGG。EGR1屬于立早基因家族(immediate early genes, IEGs)中的一員,該家族基因的共同特點是在受到一系列外界刺激后能迅速短時間激活。EGR1受多種上游分子的調(diào)控并結(jié)合到下游分子啟動子區(qū)域的特定序列,當(dāng)受到某種刺激因子作用后可快速誘導(dǎo)和表達并通過其下游分子發(fā)揮功能。EGR1在正常體細(xì)胞中幾乎不表達或者表達量很低,當(dāng)細(xì)胞受到多種細(xì)胞外信號刺激時,機體可通過一個或多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活EGR1的轉(zhuǎn)錄�；罨腅GRl與靶基因啟動子上特異的結(jié)合位點結(jié)合后,可調(diào)節(jié)細(xì)胞功能,發(fā)揮各種生物學(xué)效應(yīng)。缺血缺氧作為外源性刺激,可誘導(dǎo)細(xì)胞快速過表達EGRl。作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子,EGR1在調(diào)控細(xì)胞生長、分化、發(fā)育、增殖、炎性反應(yīng)等方面都發(fā)揮著重要作用,尤其在炎性反應(yīng)當(dāng)中,可啟動和放大炎癥反應(yīng)。在缺血性腦卒中后的腦組織中,過表達的EGR1所誘導(dǎo)的卒中后炎性反應(yīng),可能使缺血腦組織遭受二次損傷。目的作為神經(jīng)營養(yǎng)素家族中至關(guān)重要的一員,BDNF具有潛在神經(jīng)保護作用,但始終止步于動物實驗,在臨床研究中并未得到預(yù)期效果。同時,EGR1作為立早基因家族中的一員,其過量表達對缺血性卒中的預(yù)后有著不良效應(yīng)。使用siRNA技術(shù)降低血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的EGR1水平,可發(fā)揮缺血細(xì)胞的保護作用。通過生物信息學(xué)檢索,我們發(fā)現(xiàn)在BDNF啟動子上游含有EGR1的結(jié)合序列。因此,我們推測,EGR1有可能通過與BDNF啟動子保守區(qū)域結(jié)合,降低BDNF的表達,從而影響缺血性卒中的預(yù)后。本研究旨在證明EGR1通過調(diào)節(jié)BDNF的表達,負(fù)面影響了缺血性卒中的預(yù)后。方法本實驗包括在體和離體兩部分。在體實驗部分,選取的動物是由南京大學(xué)模式動物研究所提供的健康雄性SPF級、7-8周齡C57BL/6小鼠。為準(zhǔn)確模擬缺血性卒中,對部分實驗動物進行了線栓法大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型手術(shù)。為了探討EGR1是否通過調(diào)節(jié)BDNF的表達而影響卒中的預(yù)后,分別構(gòu)建了過表達EGR1(LV-EGR1)、沉默EGR1 (LV-shEGR1)以及空載對照(LV-control)的慢病毒,經(jīng)、Vesternblot驗證后再應(yīng)用于動物在體研究。在體實驗中,小鼠共分為5組：假手術(shù)(Sham+DMEM)組、空白對照(MCAO+DMEM)組、空載對照(MCAO+LV-control)組、過表達(MCAO+LV-EGR1)組、沉默(MCAO+shEGR1)組,其中DMEM是慢病毒的溶劑。除了假手術(shù)組,其它組的小鼠都進行了MCAO模型手術(shù),術(shù)前6d側(cè)腦室分別注射溶劑DMEM、慢病毒LV-control、LV-EGR1和]V-shEGR1,而Sham組小鼠進行造模手術(shù),但線栓未堵住大腦中動脈開口處。給藥后24 h取腦組織進行分析。離體實驗部分獲取16-17 d C57BL/6胎鼠大腦皮層,以原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞,待培養(yǎng)至第5d左右用于實驗。為模擬缺血缺氧狀態(tài),同一批培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞中部分予以適當(dāng)時間糖氧剝奪(oxygen glucose deprivation, OGD)。培養(yǎng)的細(xì)胞同樣分為5組：Sham組、空白對照(OGD+DMEM)組、空載對照(OGD+LV-control)組、過表達(OGD+LV-EGR1)組、沉默(OGD+shEGR1)組。給需要進行OGD的神經(jīng)元2 h的OGD和24 h的再灌注損傷,各組間分別給予溶劑DMEM、慢病毒LV-control、LV-EGR1和]V-shEGR1后48h再予進行OGD處理。為了驗證慢病毒構(gòu)建是否成功,用Western Blot的方法分別檢測了293T細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和腦組織中給予慢病毒72 h、72 h、7 d后EGR1表達的變化。為明確EGR1對缺血性卒中預(yù)后的影響,我們用氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)染色法來評估梗死體積,采用Fluoro-Jade C(FJC)染色法檢測變性神經(jīng)元,采用原位末端標(biāo)記(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)法檢測凋亡細(xì)胞。為了探究EGR1影響缺血性卒中預(yù)后的可能機制,我們采用Western blot檢測了在體和離體缺血缺氧模型建立后以及給予各類慢病毒后EGR1和BDNF的表達水平。此外,還用免疫熒光共染的方式檢測了腦組織中和體外培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞中同一個細(xì)胞內(nèi)EGR1和BDNF的表達情況。最后,為了探索EGR1是否通過作用于BDNF啟動子而影響其表達,我們運用了電泳遷移率實驗(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)和染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chtromatin immunoprecipitation, ChIP)分析了兩者的結(jié)合情況。結(jié)果Western blot研究表明,在未給予慢病毒進行干預(yù)的情況下,缺血缺氧后EGR1和BDNF的表達水平明顯上升,并于24h達高峰,直到48h仍處于較高狀態(tài),但較24h顯著下降。在驗證慢病毒構(gòu)建有效性的時發(fā)現(xiàn),給予過表達的EGR1慢病毒后,EGR1在293T細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和腦組織中的表達水平較空白對照組(*P0.05)和空載病毒組(#P0.05)顯著升高,而給予沉默EGR1的慢病毒后其表達水平則處于明顯下調(diào)狀態(tài)。這一結(jié)果表明我們成功構(gòu)建了過表達和沉默EGR1慢病毒。針對神經(jīng)元細(xì)胞和腦組織的Western blot研究均表明,在過表達EGR1后,BDNF水平有所下降,而沉默EGR1后,BDNF表達水平明顯上升。TTC染色法發(fā)現(xiàn),在給予過表達EGR1慢病毒后梗死體積較空白對照組明顯增加(過表達組vs.空白對照組：26.93±3.98%vs.20.61±2.38%,P0.05),與空載對照組相比也有所增加(過表達組vs.空載對照組：26.93±3.98%vs.21.13±1.39%,P0.05)；而在給予了沉默EGR1的慢病毒后梗死體積較空白對照組明顯減少(過表達組vs.空白對照組：13.54±3.43%vs.20.61±2.38%,P0.05),與LV-control組相比同樣也減少(過表達組vs.空載對照組：13.54±3.43%vs.21.13±1.39%,P0.05)。FJC染色和TUNEL染色表明,在過表達組有更多的FJC陽性細(xì)胞和TUNEL陽性細(xì)胞,而沉默組、空白對照與空載對照相比FJC陽性細(xì)胞和TUNEL陽性細(xì)胞明顯減少。Western blot和免疫熒光共染的結(jié)果表明,缺血缺氧后EGR1和BDNF表達升高,過表達組EGR1的表達水平較空白對照組(*P0.05)和空載病毒組(#P0.05)顯著升高,而BDNF的表達水平則恰好相反,與空白對照組(’P0.05)和空載病毒組(#p0.05)相比明顯降低。反之,在沉默組,EGR1水平明顯下降,而BDNF的水平剛處于上調(diào)狀態(tài)。最后,EMSA實驗表明,核蛋白產(chǎn)物可以和BDNF啟動子結(jié)合,EGR1特異性抗體加入后出現(xiàn)超遷移帶提示與BDNF啟動子結(jié)合的蛋白確實是EGR1蛋白。同時ChIP實驗結(jié)果也表明,EGR1可以結(jié)合于BDNF啟動子上。結(jié)論腦組織缺血缺氧后,EGR1和BDNF的表達水平均明顯升高。過表達的EGR1通過抑制BDNF的表達從而阻礙缺血性卒中的恢復(fù)。抑制EGR1的表達可能成為缺血卒中的一個潛在治療方法。
【關(guān)鍵詞】：EGR1 BDNF 梗死體積 缺血性卒中
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743.3
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 緒言17-19
• 1. 前言19-21
• 2. 材料與方法21-57
• 3. 結(jié)果57-69
• 4. 討論69-71
• 5. 結(jié)論71-72
• 參考文獻72-75
• 功讀學(xué)位期間成果75-77
• 縮略詞表77-80
• 致謝80-82

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本文編號：508972