本文關(guān)鍵詞：PPARγ保護原代皮層神經(jīng)元過氧化氫損傷的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的:觀察過氧化氫(H2O2)誘導的體外原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元損傷中,過氧化物酶體增殖物激活受體g(PPARg)的表達及活性改變,以及PPARg激活或抑制對神經(jīng)元過氧化氫損傷產(chǎn)生的影響,探討PPARg對神經(jīng)元氧化應激損傷的保護作用。實驗方法:1、原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元:取出生24h之內(nèi)Sprague-Dawley新生鼠皮層神經(jīng)元細胞進行體外原代培養(yǎng),培養(yǎng)7天(d7)進行純度鑒定,并用于各種處理和檢測。2、神經(jīng)元過氧化氫損傷模型:以不同濃度的過氧化氫作用于d7神經(jīng)元,于不同作用時間后進行評價,選取合適濃度及作用時間應用于后續(xù)實驗。3、細胞形態(tài)學觀察:包括光鏡下觀察,即將不同組別細胞置于將倒置相差顯微鏡下,觀察其形態(tài)變化,并采集圖像;神經(jīng)元MAP2免疫熒光染色,即用MAP2抗體標記神經(jīng)元,熒光顯微鏡下觀察不同組別細胞形態(tài)完整性的改變,并采集圖像。4、MTT比色法檢測細胞相對存活率,即檢測不同組別神經(jīng)元經(jīng)處理后細胞活性的改變。5、分別提取總蛋白和核蛋白,Western blotting法檢測不同組別細胞內(nèi)PPARγ、p-PPARγ(磷酸化PPARγ)、p-ERK1/2(磷酸化ERK1/2,即ERK1/2的活性形式)、Bcl-2、活化的Caspase-3、Nrf2的表達水平。6、qRT-PCR法觀察PPARγ靶基因:提取不同組別神經(jīng)元RNA,qRT-PCR技術(shù)對PPARγ靶基因表達水平進行檢測。7、ELISA法檢測PPARγ-DNA結(jié)合活性:應用PPARγ轉(zhuǎn)錄因子分析試劑盒檢測不同組別神經(jīng)元PPARγ與過氧化物酶體增殖物反應元件(PPRE)的結(jié)合活性。8、反義寡核苷酸法降低神經(jīng)元PPARγ:用PPARγ反義寡核苷酸處理原代培養(yǎng)d7神經(jīng)元細胞,抑制PPARγ表達。實驗結(jié)果:1、體外培養(yǎng)正常皮層神經(jīng)元2d后,大多細胞呈圓形或橢圓形,可見較細小的細胞突起,至第7天時神經(jīng)元胞體立體感強,形態(tài)飽滿,突起變長且增粗,并相互交織成網(wǎng)。用神經(jīng)元特異性抗體微管相關(guān)蛋白2(MAP2)對進行免疫熒光染色,鑒定神經(jīng)元陽性率達95%以上,是相對純的神經(jīng)元培養(yǎng),可用于后續(xù)實驗。2、將過氧化氫作用于神經(jīng)元,可造成神經(jīng)元損傷,輕者細胞腫脹變圓,細胞突起斷裂或消失;重者細胞發(fā)生崩解,可見較多細胞碎片,并呈現(xiàn)劑量-時程依賴效應。選取濃度為500mM、作用6~24小時進行后續(xù)實驗。3、過氧化氫抑制神經(jīng)元PPARg蛋白表達,同時增加PPARg滅活;抑制ERK1/2激活可以拮抗過氧化氫對PPARg的滅活作用。4、外源性給予PPARg激動劑羅格列酮減輕神經(jīng)元過氧化氫損傷、增加Bcl-2及Nrf2表達,同時抑制活化的Caspase-3表達;而PPARg抑制劑GW9662可以拮抗羅格列酮的保護作用、降低Bcl-2及Nrf2表達、增加活化的Caspase-3表達。5、降低PPARg表達,對正�；A(chǔ)狀態(tài)下的神經(jīng)元形態(tài)和存活率無明顯影響,但使神經(jīng)元對過氧化氫損傷更敏感,增加過氧化氫誘導的Bcl-2、Nrf2、活化的Caspase-3表達的改變,同時可以降低外源性給予PPARg激動劑羅格列酮所產(chǎn)生的保護作用。實驗結(jié)論:1、在體外原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元中,過氧化氫可能通過負性調(diào)節(jié)PPARg(即表達下調(diào)和活性降低)引起神經(jīng)元損傷。2、在體外原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元中,外源性激活PPARγ可以保護神經(jīng)元過氧化氫損傷,而神經(jīng)元自身PPARγ的表達可能是神經(jīng)元自我保護機制之一。3、PPARγ的神經(jīng)保護作用可能部分通過抑制活化的Caspase-3、上調(diào)Bcl-2抗凋亡蛋白,以及增加抗氧化應激轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的表達實現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：皮層神經(jīng)元 過氧化氫 PPARγ 神經(jīng)保護 氧化應激 Bcl2 Caspase-3 Nrf2
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R741
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 符號說明10-13
• 前言13-16
• 研究現(xiàn)狀、成果13-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、過氧化氫損傷神經(jīng)元中PPARγ表達及活性的研究16-36
• 1.1 對象和方法16-29
• 1.1.1 實驗動物16
• 1.1.2 主要儀器設備16-17
• 1.1.3 實驗試劑及耗材17-19
• 1.1.4 主要溶液及試劑配方19-22
• 1.1.5 實驗方法22-29
• 1.1.6 統(tǒng)計學處理29
• 1.2 實驗結(jié)果29-36
• 1.2.1 皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)及過氧化氫損傷29-32
• 1.2.1.1 原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元形態(tài)學觀察及純度鑒定29-31
• 1.2.1.2 過氧化氫損傷神經(jīng)元形態(tài)學觀察及細胞相對存活率評價31-32
• 1.2.2 過氧化氫抑制皮層神經(jīng)元PPARγ 表達32-33
• 1.2.3 過氧化氫增加皮層神經(jīng)元PPARγ 滅活33-34
• 1.2.3.1 過氧化氫增加磷酸化PPARγ（p-PPARγ）/PPARγ 比值33
• 1.2.3.2 ERK1/2 激活介導了過氧化氫誘導的PPARγ 滅活33-34
• 1.2.4 過氧化氫抑制神經(jīng)元PPARγ 活性34-36
• 1.2.4.1 過氧化氫下調(diào)PPARγ 靶基因表達34
• 1.2.4.2 過氧化氫抑制神經(jīng)元PPARγ-DNA結(jié)合活性34-36
• 二、PPARγ保護神經(jīng)元過氧化氫損傷的研究36-48
• 2.1 對象和方法36-38
• 2.1.1 實驗動物36
• 2.1.2 主要儀器設備36
• 2.1.3 實驗試劑及耗材36
• 2.1.4 主要溶液及試劑配方36-37
• 2.1.5 實驗方法37-38
• 2.1.6 統(tǒng)計學處理38
• 2.2 實驗結(jié)果38-48
• 2.2.1 PPARγ 激動劑羅格列酮對皮層神經(jīng)元過氧化氫損傷的保護作用38-40
• 2.2.1.1 細胞形態(tài)學觀察38-39
• 2.2.1.2 細胞相對存活率評價39-40
• 2.2.1.3 Bcl-2、Caspase-3、Nrf2蛋白表達40
• 2.2.2 PPARγ 拮抗劑GW9662抑制羅格列酮對神經(jīng)元過氧化氫損傷的保護作用40-43
• 2.2.2.1 細胞形態(tài)學觀察40-41
• 2.2.2.2 細胞相對存活率評價41-42
• 2.2.2.3 Bcl-2、Caspase-3、Nrf2蛋白表達42-43
• 2.2.3 抑制PPARγ 增加皮層神經(jīng)元對過氧化氫損傷的敏感性43-48
• 2.2.3.1 PPARγ 反義寡核苷酸抑制體外正常培養(yǎng)皮層神經(jīng)元PPARγ 及其靶基因表達43-44
• 2.2.3.2 asON-PPARγ 加重神經(jīng)元過氧化氫損傷44-45
• 2.2.3.3 asON-PPARγ 降低PPARγ 激動劑對神經(jīng)元過氧化氫損傷的保護作用45-48
• 三、討論48-55
• 3.1 過氧化氫對神經(jīng)元細胞PPARγ 的負性調(diào)節(jié)作用48-50
• 3.2 神經(jīng)元PPARγ 保護過氧化氫的細胞損傷作用50-55
• 結(jié)論55-56
• 參考文獻56-68
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明68-69
• 綜述 ERK1/2 信號轉(zhuǎn)導通路的作用69-80
• 綜述參考文獻74-80
• 致謝80

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