本文關鍵詞：高滲鹽水通過Notch信號通路減輕腦缺血炎癥反應的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：缺血性腦卒中是臨床上常見神經(jīng)系統(tǒng)疾病,腦缺血灶周圍的炎癥因子可加重腦組織損害。這些炎癥因子主要來源于小膠質(zhì)細胞；激活的小膠質(zhì)細胞可釋放產(chǎn)生大量TNF-α、ROS、IL-6等炎癥因子等加重腦組織損害。NF-κB信號通路是被廣泛認為是調(diào)節(jié)腦缺血損傷后炎癥因子釋放的重要信號通路。近年來有研究表明Notch是NF-κB信號通路的上游調(diào)控點,DAPT抑制Notch信號通路可明顯減少細胞核內(nèi)NF-κB的分布,降低NF-κB轉(zhuǎn)錄活性；另一方面,激活Notch信號通路可上調(diào)NF-κB的活性。Notch信號通路在免疫細胞應答外界刺激和感染中也具有重要作用。有研究表明阻斷Notch信號通路可明顯減少神經(jīng)元凋亡、減少激活的小膠質(zhì)細胞數(shù)量,減少炎癥因子IL-6、IL-1β、 M-CSF的釋放以及降低腦梗死面積,提高神經(jīng)行為功能。高滲鹽水(HS)是指南推薦治療腦水腫的滲透性藥物,廣泛應用于腦梗死、腦出血、腦外傷的患者,能有效治療急性腦血管疾病引起的顱內(nèi)高壓。目前高滲鹽水治療腦損傷的滲透性機制已被廣為研究,但是其非滲透性機制卻越來越受關注。有研究表明高滲鹽水具有神經(jīng)保護作用并能降低腦梗死患者的死亡率。一些文獻報道高滲鹽水可以降低巨噬細胞的激活,從而減輕炎癥反應。課題組前期研究表明：10%HS治療可降低腦梗死側腦水含量、減小腦梗死體積；并且明顯減少腦梗死灶周圍小膠質(zhì)細胞釋放炎癥因子TNF-α、IL-1β。在本實驗研究中,我們建立大腦中動脈栓塞的大鼠缺血性腦卒中模型,同時；采用缺氧無糖培養(yǎng)BV-2小膠質(zhì)細胞模擬體內(nèi)腦缺血損傷模型,檢測缺血／缺氧損傷后Notch信號通路中Notch-1、NICD、RBP-JK、Hes-1的變化及炎癥因Phos-NF-κB子iNOS、IL-1β、ROS的變化；HS對炎癥因子及Notch信號通路的影響；此外,利用Notch信號通路特異性抑制劑DAPT;觀察藥物阻斷Notch信號通路對BV-2細胞釋放炎癥因子的影響。探討高滲鹽水是否通過Notch信號通路抑制腦缺血后炎癥因子的釋放。第一章高滲鹽水對腦缺血灶周圍炎癥因子的影響目的：建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型,探索10%高滲鹽水對腦缺血損傷后缺血灶周圍炎癥因子誘導型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase, iNOS)、白介素-1β (interleukin-1 beta,IL-1β)的影響。方法：220-250g成年SPF級雄性SD大鼠,隨機分為假手術組、腦缺血組、生理鹽水組(簡稱NS組)、10%高滲鹽水治療組(簡稱10%HS組)。除假手術組大鼠外,其他各組大鼠采用線栓法復制右側大腦中動脈局灶腦缺血模型,缺血2h后實施再灌注,以再灌注的時間點作為治療起點,NS組和10%HS組按0.3 mL/h分別經(jīng)尾靜脈勻速泵入生理鹽水和10%高滲鹽水。以治療時間分兩個亞組,分別為治療12h組和24h組；治療12h或24 h后提取缺血側大腦半球,免疫雙熒光法檢測缺血灶周圍iNOS、IL-1β與小膠質(zhì)細胞(Lectin標記)的共定位表達；Western Blot方法檢測腦缺血再灌注損傷12h及24h后缺血灶周圍大腦皮層組織中iNOS的蛋白表達水平,數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,用LSD法進行組間兩兩比較,P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。結果：免疫雙熒光提示假手術組小膠質(zhì)細胞呈分枝狀,iNOS及IL-1p幾乎不表達于小膠質(zhì)細胞；腦缺血損傷后,小膠質(zhì)細胞被激活,細胞形態(tài)呈圓形或阿米巴形,腦缺血組與NS組iNOS及IL-1p在小膠質(zhì)細胞上的表達明顯增加；10%HS治療24h后,iNOS及IL-1p在小膠質(zhì)細胞上的表達明顯減少。Western Blot提示：與假手術組比較,腦缺血損傷12h或24h后腦缺血組與生理鹽水組腦缺血灶周圍大腦皮層組織中iNOS的蛋白表達水平明顯增加(*P0.05)；與腦缺血組比較,生理鹽水治療12h或24h后腦缺血灶周圍皮層組織中iNOS的蛋白表達水平無明顯變化(P0.05)；與腦缺血組及生理鹽水組比較,10%高滲鹽水治療12h或24h后,腦缺血灶周圍皮層組織中iNOS的蛋白表達水平均明顯減少(#P0.05)。結論：高滲鹽水能抑制腦缺血灶周圍小膠質(zhì)細胞的激活并抑制小膠質(zhì)細胞釋放炎癥因子iNOS、IL-1β。第二章高滲鹽水對腦缺血灶周圍Notch信號通路的影響目的：建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型,探索腦缺血損傷后Notch信號通路的改變及高滲鹽水對腦缺血大鼠缺血灶周圍Notch信號通路的影響。方法：220-250g成年SPF級雄性SD大鼠,隨機分為假手術組、腦缺血組、生理鹽水組(簡稱NS組)、10%高滲鹽水治療組(簡稱10%HS組)。除假手術組大鼠外,其他各組大鼠采用線栓法復制右側大腦中動脈局灶腦缺血模型,缺血2h后實施再灌注,以再灌注的時間點作為治療起點,生理鹽水組和10%高滲鹽水組按0.3 mL/h分別經(jīng)尾靜脈勻速泵入生理鹽水和10%高滲鹽水。以治療時間分兩個亞組,分別為治療12h組和24h組；治療12h或24h后提取缺血側大腦半球。采用免疫雙熒光法檢測各組大鼠腦缺血灶周圍Notch信號通路中Notch-1、 NICD、RBP-JK、Hes-1與小膠質(zhì)細胞(Lectin標記)共定位表達；采用Western Blot法檢測各組大鼠腦缺血灶周圍皮層組織中Notch信號通路中Notch-1、NICD、 RBP-JK、Hes-1的蛋白表達情況。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,用LSD法進行組間兩兩比較,P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。結果：免疫雙熒光提示假手術組小膠質(zhì)細胞呈分枝狀,缺血灶周圍小膠質(zhì)細胞幾乎不表達Notch-1與NICD、RBP-JK、Hes-1;腦缺血損傷后,腦缺血灶周圍小膠質(zhì)細胞被激活,細胞形態(tài)呈圓形或阿米巴形,腦缺血組與NS組Notch-1與NICD、RBP-JK、 Hes-1在小膠質(zhì)細胞上的表達明顯增加；10%HS治療24h后,Notch 與 NICD、RBP-JK、Hes-1在小膠質(zhì)細胞上的表達明顯減少。Western Blot提示：與假手術組比較,腦缺血損傷12h或24h后腦缺血組與NS組腦缺血灶周圍皮層組織中Notch-1與NICD、RBP-JK、Hes-1的蛋白表達水平明顯增加(*P0.05)；與腦缺血組比較,生理鹽水治療12h或24h后腦缺血灶周圍皮層組織中Notch-1與NICD、RBP-JK、Hes-1的蛋白表達水平無明顯變化(P0.05)；與腦缺血組及生理鹽水組比較,10%高滲鹽水治療12h或24h后腦缺血灶周圍皮層組織中Notch-1與NICD、RBP-JK、Hes-1的蛋白表達水平均明顯減少(#P0.05)。結論：腦缺血損傷后腦缺血灶周圍小膠質(zhì)細胞上Notch信號通路可被激活,Notch信號通路中Notch-1與NICD、RBP-JK, Hes-1的表達明顯增加；高滲鹽水可抑制大鼠腦缺血后小膠質(zhì)細胞上Notch信號通路的激活,減少Notch-1與NICD、 RBP-JK、Hes-1的表達。第三章高滲鹽水對BV-2小膠質(zhì)細胞釋放炎癥因子的影響及其機制研究目的：探討80mM HS對缺氧后BV-2小膠質(zhì)細胞釋放炎癥因子一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase, iNOS)、白介素-1β (interleukin-1 beta, IL-1β)、氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的影響及高滲鹽水是否通過Notch信號影響炎癥因子的釋放。方法：采用缺氧無糖培養(yǎng)BV-2小膠質(zhì)細胞模擬體內(nèi)腦缺血再灌注損傷模型；將BV-2小膠質(zhì)細胞細胞分為四組：對照組、缺氧無糖培養(yǎng)組、缺氧無糖培養(yǎng)+80mMHS組(縮寫為：HS組)、缺氧無糖培養(yǎng)+DAPT組(縮寫為：DAPT組),對照組細胞使用正常培養(yǎng)基在普通培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng),其它三組細胞藥物預處理1h后,在3%O2,5%CO2,92%N2的條件下缺氧無糖培養(yǎng)4小時,然后所有組細胞更換成基礎培養(yǎng)基再正常培養(yǎng)1h。采用免疫熒光法、Western Blot法檢測缺氧后BV-2小膠質(zhì)細胞Notch信號通路Notch-1與NICD、RBP-JK、Hes-1、炎癥因子Phos-NF-κB、iNOS、IL-1β的表達情況；及HS對小膠質(zhì)細胞中Notch信號通路Notch-1 與 NICD、RBP-JK、Hes-1、炎癥因子Phos-NF-κB、iNOS、IL-1β的影響；此外,采用Notch信號通路特異性阻斷劑DAPT,觀察藥物阻斷Notch信號通路對BV-2細胞釋放炎癥因子Phos-NF-κB、 iNOS、IL-1β的影響；DCFH-DA法檢測缺氧后BV-2細胞表達ROS的情況及DAPT阻斷Notch信號通路對ROS的影響和HS對缺氧后BV-2釋放ROS的影響。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,用LSD法進行組間兩兩比較,P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。結果：與對照組比較,BV-2小膠質(zhì)細胞在缺氧無糖培養(yǎng)4小時后釋放大量的炎癥因子Phos-NF-κB, iNOS, IL-1β, ROS(*P0.05);與缺氧組比較,DAPT組、HS組中炎癥因子Phos-NF-κB、iNOS、IL-1β、ROS的表達水平均明顯減少(#P0.05)；其中,免疫熒光提示缺氧無糖培養(yǎng)4h后BV-2小膠質(zhì)細胞的細胞核內(nèi) Phos-NF-KB的分布明顯增加；DAPT、HS組BV-2小膠質(zhì)細胞的細胞核內(nèi)Phos-NF-κB分布明顯減少。與對照組比較,BV-2小膠質(zhì)細胞在缺氧無糖培養(yǎng)4小時后Notch-1與NICD、RBP-JK、Hes-1表達水平均明顯增加(*P0.05),與缺氧組比較,DAPT組、HS組中NICD、RBP-JK、Hes-1的表達水平均明顯減少(#P0.05)。結論：缺氧可激活BV-2小膠質(zhì)細胞并釋放大量炎癥因子Phos-NF-κB、iNOS、 IL-1β, ROS,同時也激活BV-2小膠質(zhì)細胞Notch信號通路,Notch-1與NICD、 RBP-JK、Hes-1表達均明顯增加；HS可抑制BV-2小膠質(zhì)細胞釋放炎癥因子及其Notch信號通路的激活；藥物阻斷Notch信號通路的激活可抑制BV-2小膠質(zhì)細胞釋放炎癥因子Phos-NF-κB、 iNOS, IL-1β, ROS。提示Notch信號通路可調(diào)控NF-κB信號通路。HS可能通過抑制Notch信號通路的激活進而抑制Phos-NF-κB的核轉(zhuǎn)移,從而抑制BV-2小膠質(zhì)細胞釋放炎癥因子。
【關鍵詞】：腦缺血 高滲鹽水 Notch信號通路 缺氧無糖培養(yǎng) 小膠質(zhì)細胞 NF-κB信號通路 炎癥因子
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R743.3
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-20
• 第一章 高滲鹽水對腦缺血灶周圍炎癥因子的影響20-34
• 1 實驗目的20
• 2 實驗動物及材料20-23
• 2.1 實驗動物20
• 2.2 實驗材料20-22
• 2.3 試劑準備22-23
• 3 實驗方法23-28
• 3.1 實驗動物分組23
• 3.2 大鼠大腦中動脈局灶腦缺血再灌注模型制作23-24
• 3.3 免疫雙熒光法檢測10%HS對腦缺血灶周圍小膠質(zhì)細胞釋放炎癥因子的影響24-25
• 3.4 Western Blot法檢測10%HS對腦缺血灶周圍iNOS蛋白水平的影響25-28
• 3.5 統(tǒng)計方法28
• 4 實驗結果28-31
• 4.1 10%HS對腦缺血灶周圍小膠質(zhì)細胞釋放炎癥因子的影響28-30
• 4.2 10%HS對腦缺血灶周圍iNOS蛋白水平的影響30-31
• 5 實驗討論31-33
• 6 實驗結論33-34
• 第二章 高滲鹽水對腦缺血灶周圍Notch信號通路的影響34-46
• 1 實驗目的34
• 2 實驗動物及材料34-35
• 2.1 實驗動物34
• 2.2 實驗材料34-35
• 2.3 試劑準備35
• 3 實驗方法35-37
• 3.1 實驗動物分組35-36
• 3.2 大鼠大腦中動脈局灶腦缺血再灌注模型制作36
• 3.3 免疫雙熒光法檢測10%HS對腦缺血灶周圍Notch信號通路的影響36
• 3.4 Western Blot法檢測10%HS對腦缺血灶周圍Notch信號通路蛋白水平影響36-37
• 3.5 統(tǒng)計方法37
• 4 實驗結果37-44
• 4.1 10%HS對腦缺血灶周圍小膠質(zhì)細胞Notch信號通路的影響37-41
• 4.2 10%HS對腦缺血灶周圍Notch信號通路蛋白水平影響41-44
• 5 實驗討論44-45
• 6 實驗結論45-46
• 第三章 高滲鹽水對BV-2小膠質(zhì)細胞釋放炎癥因子的影響及其機制研究46-72
• 1 實驗目的46
• 2 實驗細胞及材料46-49
• 2.1 實驗細胞46
• 2.2 實驗材料46-48
• 2.3 試劑準備48-49
• 3 實驗方法49-56
• 3.1 實驗細胞分組49-50
• 3.2 BV-2小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)50
• 3.3 BV-2小膠質(zhì)細胞的鑒定50
• 3.4 CCK8檢測不同濃度HS對BV-2小膠質(zhì)細胞的影響50-51
• 3.5 CCK8檢測10μM DAPT對BV-2小膠質(zhì)細胞的影響51
• 3.6 免疫熒光法檢測HS及DAPT對BV-2小膠質(zhì)細胞釋放炎癥因子Phos-NF-κB、iNOS、IL-1β的影響51-52
• 3.7 DCFH-DA法檢測HS及DAPT對小膠質(zhì)細胞釋放ROS的影響52-53
• 3.8 Western Blot法檢測HS及DAPT對BV-2小膠質(zhì)細胞中炎癥因子iNOS、Phos-NF-κB、IL-1β蛋白水平的影響53-55
• 3.9 免疫熒光法檢測HS及DAPT對BV-2小膠質(zhì)細胞Notch信號通路的影響55
• 3.10 Western Blot法檢測HS及DAPT對BV-2小膠質(zhì)細胞Notch信號通路蛋白水平的影響55
• 3.11 統(tǒng)計方法55-56
• 4 實驗結果56-69
• 4.1 BV-2小膠質(zhì)細胞的鑒定56
• 4.2 不同濃度HS對BV-2小膠質(zhì)細胞的影響56-57
• 4.3 10μM DAPT對BV-2小膠質(zhì)細胞的影響57-58
• 4.4 HS及DAPT對BV-2小膠質(zhì)細胞釋放炎癥因子的影響58-61
• 4.5 HS及DAPT對小膠質(zhì)細胞釋放ROS的影響61-62
• 4.6 HS及DAPT對BV-2小膠質(zhì)細胞中炎癥因子Phos-NF-κB、iNOS、IL-1β蛋白水平的影響62-63
• 4.7 HS及DAPT對BV-2小膠質(zhì)細胞Notch信號通路的影響63-67
• 4.8 HS及DAPT對BV-2小膠質(zhì)細胞Notch信號通路蛋白水平的影響67-69
• 5 實驗討論69-71
• 6 實驗結論71-72
• 全文總結72-73
• 參考文獻73-76
• 附錄：Notch信號通路與中樞神經(jīng)系統(tǒng)（綜述）76-83
• 參考文獻81-83
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文83-84
• 致謝84-85

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本文編號：453336