本文關(guān)鍵詞：miR-29s表達(dá)異常減少對膠質(zhì)瘤遷移侵襲的作用及其機制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【目的】miR-29家族成員miR-29a、b和c(miR-29s)是一組重要的抑瘤微小RNA(TS-miRNA),其表達(dá)異常降低與多種惡性腫瘤的遷移侵襲密切相關(guān)。細(xì)胞分裂周期蛋白42(CDC42)在多種顱內(nèi)、外惡性腫瘤細(xì)胞中過表達(dá),研究顯示其可通過調(diào)控細(xì)胞骨架重排和細(xì)胞運動,直接參與腫瘤細(xì)胞的浸潤性生長。在前期研究中,我們已證實miR-29s在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中普遍低表達(dá),且其表達(dá)水平隨腫瘤良惡性級別的升高而進行性降低;熒光素酶實驗亦證實CDC42是miR-29s的天然靶基因。但是,miR-29s表達(dá)異常是否是膠質(zhì)瘤胞獲得活躍遷移侵襲能力的重要原因,CDC42及其下游相關(guān)通路是否是miR-29s易化膠質(zhì)瘤侵襲遷移的關(guān)鍵靶點和關(guān)鍵效應(yīng)通路,目前仍不清楚。本研究即對上述問題進行深入探討�！痉椒ā竣乓匀四z質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87MG和U251MG為研究對象,利用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染miR-29a、b、c mimics和無義對照序列(Scr),建立miR-29a/b/c轉(zhuǎn)染組和Scr組,同時以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系作為空白對照組(Mock);利用stem-loop qRT-PCR檢測各組miR-29a/b/c的表達(dá)水平;通過體外遷移侵襲實驗觀察miR-29a/b/c對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲遷移的影響。⑵利用qRT-PCR和Western blot觀察miR-29a/b/c對CDC42 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響,明確其與膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲能力之間的關(guān)系。⑶通過轉(zhuǎn)染miR-29a、b、c mimics等量混合物(miR-29mimics mix)構(gòu)建miR-29s轉(zhuǎn)染組,共轉(zhuǎn)染miR-29 mimics mix和CDC42過表達(dá)質(zhì)粒p-CDC42構(gòu)建miR-29s+CDC42轉(zhuǎn)染組,共轉(zhuǎn)染CDC42特異性siRNA和p-CDC42構(gòu)建siRNA+CDC42轉(zhuǎn)染組,以Mock及Scr轉(zhuǎn)染組為對照,對比各組CDC42的表達(dá)水平及其遷移侵襲能力;⑷觀察上述各組腫瘤細(xì)胞內(nèi)磷酸化PAK1/2/3、LIMK1/2及cofilin(p-PAK1/2/3、p-LIMK1/2及p-cofilin)含量的變化,明確敲低內(nèi)源性CDC42表達(dá)及補充外源性CDC42對PAK/LIMK/cofilin通路生物學(xué)活性的影響,明確其與膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲遷移能力的關(guān)系�！狙芯拷Y(jié)果】⑴與Mock和Scr組相比,miR29a/b/c轉(zhuǎn)染組miR-29a/b/c含量明顯升高,而遷移侵襲細(xì)胞數(shù)明顯降低,證實miR-29a/b/c能有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力。⑵與Mock和Scr組相比,miR29a/b/c轉(zhuǎn)染組CDC42 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低,證實miR-29a/b/c可以誘導(dǎo)CDC42 mRNA的降解并阻斷其編碼蛋白的表達(dá)。⑶miR-29 mimics mix及CDC42特異性siRNA均可有效敲低CDC42蛋白的表達(dá)水平,并模擬miR-29a/b/c對U87-和U251MG細(xì)胞遷移侵襲的抑制作用,而經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染外源性CDC42可有效逆轉(zhuǎn)miR-29 mimics mix及C DC42特異性siRNA的上述抑瘤效應(yīng),進一步證實CDC42是miR-29s抑制膠質(zhì)瘤侵潤性生長的關(guān)鍵靶點,并提示CDC42異常過表達(dá)可能是導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞獲得活躍遷移侵襲能力的重要原因。⑷miR-29 mimics mix及CDC42特異性siRNA轉(zhuǎn)染均可使U87-/U251MG細(xì)胞系p-PAK1/2/3、p-LIMK1/2和p-cofilin含量明顯低于相應(yīng)Mock及Scr組,而轉(zhuǎn)染外源性CDC42可逆轉(zhuǎn)上述干預(yù)因素對PAK、LIMK及cofilin磷酸化的影響;鑒于磷酸化對cofilin F-肌動蛋白解聚酶活性的抑制作用及其在腫瘤細(xì)胞片狀偽足形成和遷移過程中的重要作用,上述結(jié)果證實PAK/LIMK/cofilin是CDC42調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲能力的重要效應(yīng)通路,而miR-29s通過敲低CDC42蛋白的表達(dá)、下調(diào)PAK/LIMK/cofilin通路的生物活性發(fā)揮抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲的作用。【結(jié)論】⑴miR-29a,b及c(miR-29s)可有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移侵襲,miR-29s異常低表達(dá)是膠質(zhì)瘤細(xì)胞獲得活躍遷移侵襲能力的重要分子機制。⑵在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CDC42是miR-29s的天然靶基因,miR-29s可通過降解其mRNA特異性地抑制CDC42蛋白的表達(dá)。⑶CDC42是調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力的重要因子,也是miR-29s抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲的關(guān)鍵靶點。⑷PAK/LIMK/cofilin是C DC42調(diào)節(jié)細(xì)胞運動及腫瘤細(xì)胞遷移侵襲的關(guān)鍵效應(yīng)通路,CDC42通過該通路誘導(dǎo)cofilin磷酸化,從而起到促進膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲的作用。⑸miR-29s通過敲低膠質(zhì)瘤細(xì)胞CDC42的表達(dá)抑制PAK/LIMK/cofilin通路的生物活性,這是其抑制膠質(zhì)瘤遷移、侵襲重要分子機制。⑹本研究結(jié)果提示,CDC42及其下游PAK/LIMK/cofilin通路可作為阻遏膠質(zhì)瘤侵襲性生長的關(guān)鍵靶點和靶通路,而miR-29s可作為潛在干預(yù)因子用于惡性膠質(zhì)瘤的基因干預(yù)及分子靶向治療。
【關(guān)鍵詞】：膠質(zhì)瘤 miR-29 細(xì)胞分裂周期蛋白42 遷移 侵襲
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.41
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語/符號說明11-12
• 前言12-15
• 研究現(xiàn)狀、成果12-13
• 研究目的、方法13-15
• 材料與方法15-26
• 1. 主要實驗儀器15
• 2. 實驗材料15-16
• 2.1 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和培養(yǎng)基15
• 2.2 mimics、siRN A及qRT-PCR檢測試劑盒15-16
• 2.3 Western blot試劑盒16
• 2.4 其它重要試劑16
• 3. 實驗方法16-26
• 3.1 miR-29a/b/c轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率的鑒定16-19
• 3.2 miR-29a/b/c對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲遷移影響的檢測19-20
• 3.3 miR-29a/b/c對CDC42表達(dá)水平影響的檢測20-24
• 3.4 外源性CDC42對miR-29抑制膠質(zhì)瘤遷移侵襲的干預(yù)實驗24
• 3.5 CDC42特異性siRN A對抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲影響的檢測24-25
• 3.6 敲低CDC42對PAK、LIMK和cofilin磷酸化影響的檢測25
• 3.7 統(tǒng)計學(xué)方法25-26
• 結(jié)果26-45
• 1. 轉(zhuǎn)染mimics可有效提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-29a/b/c的含量26-27
• 2. miR-29a/b/c抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移侵襲27-29
• 3.miR-29a/b/c敲低膠質(zhì)瘤細(xì)胞CDC42的表達(dá)29-31
• 4. 外源性CDC42可逆轉(zhuǎn)miR-29s對遷移侵襲的抑制作用31-35
• 5. CDC42逆轉(zhuǎn)siRNA對膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲的抑制作用35-38
• 6. miR-29s和siRN A可降低PAK、LIMK、cofilin蛋白的磷酸化38-45
• 討論45-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-57
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明57-58
• 綜述 CDC42下游靶基因和生物學(xué)功能58-72
• 綜述參考文獻(xiàn)67-72
• 致謝72

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本文編號：428126