本文關(guān)鍵詞：骨骼肌細胞再生在mdx小鼠中的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:杜興型肌營養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是肌纖維膜抗肌萎縮蛋白(dystrophin)完全缺失導(dǎo)致的一種進行性肌營養(yǎng)不良,為進行性肌營養(yǎng)不良中發(fā)病率最高的類型之一。該病一種X連鎖隱性遺傳的致死性肌病。其主要表現(xiàn)為緩慢進行性加重的對稱性肌無力和萎縮,首發(fā)癥狀為骨盆帶肌肌群無力,腓腸肌假性肥大。經(jīng)大量研究,有多種病理生理機制參與了疾病的形成與發(fā)展,如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、自噬凋亡、細胞內(nèi)鈣超載等。無論哪一種改變均可引起肌細胞的變性壞死,如何修復(fù)變性壞死的肌細胞,促進肌細胞再生,恢復(fù)肌肉組織的功能成為我們研究的重點。mdx小鼠是目前研究肌營養(yǎng)不良的經(jīng)典模型,與DMD患者一樣,mdx小鼠骨骼肌細胞膜上不表達dystrophin蛋白。mdx小鼠的組織學(xué)在早期是正常的,在3周左右出現(xiàn)肌細胞變性壞死,表現(xiàn)出肌無力癥狀,隨著疾病發(fā)展,肌細胞再生占據(jù)主導(dǎo)地位,病情趨于平穩(wěn),無力癥狀得到改善。而DMD患者肌細胞再生并不明顯,無力癥狀逐漸加重,最終失去行走能力,甚至死亡。DMD患者與mdx小鼠發(fā)病機制均為骨骼肌細胞膜上dystrophin蛋白缺失,但mdx小鼠的臨床表現(xiàn)要比人類輕很多,mdx小鼠肌力低下輕度的原因可能是肌細胞再生對壞死過程的代償良好所致,可見肌細胞再生在改善癥狀,延緩病情進展方面起到了舉足輕重的作用。骨骼肌再生是機體為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)以及生長發(fā)育所必需的生理過程。再生過程涉及:骨骼肌細胞變性壞死,炎癥反應(yīng)的激活,炎癥細胞因子的釋放,靜止的肌衛(wèi)星細胞的激活,成肌細胞增殖分化形成成熟肌纖維。而肌衛(wèi)星細胞是參與肌細胞再生的重要細胞類型,這些細胞在激活之后能夠增殖分化成新的肌纖維,是動物出生后骨骼肌生長和肌再生的主要細胞來源。本研究旨在觀察DMD患者與mdx小鼠肌肉組織病理學(xué)差異,研究mdx小鼠骨骼肌細胞再生相關(guān)基因在不同時期的差異性表達,以及神經(jīng)細胞抑制生長因子(Necdin)和腦表達X-連鎖蛋白1(bex1)基因在mdx小鼠及對照鼠中的表達,探討Necdin、bex1與mdx小鼠肌細胞再生的相關(guān)性。為進一步探討肌衛(wèi)星細胞的激活因子相關(guān)基因?qū)I養(yǎng)不良患者治療的可行性提供理論依據(jù)。方法:實驗分為兩部分:實驗一,觀察DMD患者及mdx小鼠與對照鼠的肌肉組織在病理組織學(xué)上的特征。實驗二,探索肌再生相關(guān)基因在mdx小鼠不同時期的差異性表達。實驗一:選取DMD患者及正常人,各三例。所有受試者均經(jīng)光鏡、電鏡檢查后確診。每位受試者均簽署了知情同意書,并對肱二頭肌或股四頭肌或腓腸肌行開放式肌活檢。受試者的活檢肌肉均進行常規(guī)組織學(xué)和免疫組織學(xué)染色。選取雄性C57BL/10Sc Sn-Dmdmdx/JNju小鼠為實驗鼠,根據(jù)肌肉組織病理學(xué)變化分為2周組、4周組、8周組、12周組。選取雄性C57BL/6Sc Sn小鼠為對照鼠,同樣分為2周組、4周組、8周組、12周組,每組各3只。以10%水合氯醛(350mg/Kg體重)腹腔注射麻醉,取小鼠雙側(cè)股四頭肌,進行常規(guī)組織學(xué)染色。實驗二:實驗鼠與對照鼠的選取、分組及取材同上,每組各3只,分別用于基因表達譜研究及q RT-PCR檢測。利用基因芯片技術(shù)觀察肌再生相關(guān)基因在mdx小鼠不同時期的差異性表達,并通過q RT-PCR技術(shù)探索mdx小鼠與對照鼠不同時期Necdin、bex1基因的表達情況。并應(yīng)用spss13.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果:1 DMD患者肌肉組織的病理學(xué)特征。通過常規(guī)染色觀察癥狀早期及終末期的DMD患者的組織病理學(xué)變化。癥狀早期的患者可見肌纖維大小不等,基本呈圓形外觀,可見肌纖維變性、壞死、再生,炎癥細胞浸潤。終末期患者可見肌肉組織中結(jié)締組織和脂肪組織明顯增生,僅殘存少量肌纖維。免疫組織化學(xué)染色顯示DMD患者Dystrophin蛋白在肌纖維膜上完全缺失。2 mdx小鼠肌肉組織不同時期的病理學(xué)特征。通過常規(guī)染色動態(tài)觀察mdx小鼠及對照鼠不同時期的的組織病理學(xué)變化。2周:mdx小鼠肌肉組織開始出現(xiàn)散在肌纖維的變性壞死及炎癥細胞的浸潤。同齡對照鼠基本沒有肌纖維的壞死。4周:mdx小鼠出現(xiàn)大量肌纖維的變性及成群肌纖維的壞死,同時伴有較多炎癥細胞的浸潤,可見散在以中心核、嗜堿性胞漿為特征的再生肌纖維。同齡正常對照小鼠無上述病理改變。8周:再生肌纖維成群存在,壞死肌纖維散在分布。同齡正常對照小鼠未見明顯再生肌纖維。12周:絕大多數(shù)肌細胞具有多個核,且細胞核逐漸向肌膜周邊分布,肌細胞趨于成熟。同齡正常對照小鼠無上述病理改變。3基因芯片結(jié)果(1)聚類分析結(jié)果將對mdx小鼠4組樣本得到的差異基因進行聚類分析,聚類分析后得到聚類熱圖,每組mdx小鼠樣本均聚類在一起。其中2周組與12周組相比較差異表達基因較明顯。(2)基因篩選結(jié)果對2周與12周mdx小鼠股四頭肌組織的基因檢測結(jié)果進行比較,取P"f0.05,Fould-Change"g+2,Fould-Change"f㧟2為篩選基因的條件,差異表達基因共2928個,與肌細胞再生相關(guān)的基因約有368個,表達上調(diào)的基因有271個,表達下調(diào)的基因有97個。部分差異基因見表1。其中Necdin基因Fould-Change=10.1611,bex1基因Fould-Change=-2.87293。4 Necdin、bex1基因在mdx小鼠及對照鼠骨骼肌細胞中不同時期的表達。通過q RT-PCR發(fā)現(xiàn),Necdin與bex1存在于正常小鼠的骨骼肌細胞中。與對照組相比,mdx小鼠4周組和8周組股四頭肌中Necdin及bex1基因表達量升高,mdx2周組表達量降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在mdx小鼠自身對照中,8周組股四頭肌中Necdin與bex1基因表達含量最高,與其他組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在正常對照小鼠的自身對照中,2周組股四頭肌Necdin與bex1基因表達含量最高,與其他組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),且隨著時間延長表達量逐漸降低。結(jié)論:1通過DMD患者與mdx小鼠的肌肉組織病理學(xué)觀察,DMD患者的肌纖維的再生遠不如mdx小鼠明顯。2參與調(diào)控mdx小鼠肌細胞再生的基因很多。Necdin與bex1存在于正常小鼠的骨骼肌細胞中,且在小鼠生長發(fā)育的早期階段含量較高。Necdin與bex1在促進mdx小鼠肌細胞分化過程中起到一定作用。Necdin與bex1可能通過激活肌衛(wèi)星細胞促進肌細胞再生。
【關(guān)鍵詞】：骨骼肌細胞再生 mdx小鼠 基因表達譜 Necdin bex1
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R746.2
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-15
• 材料與方法15-22
• 結(jié)果22-24
• 附圖24-30
• 附表30-33
• 討論33-37
• 結(jié)論37
• 參考文獻37-42
• 綜述 調(diào)節(jié)骨骼肌細胞再生的細胞因子研究進展42-53
• 參考文獻47-53
• 致謝53-54
• 個人簡歷54

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本文編號：427441