依達拉奉體外定向誘導人臍帶間充質干細胞分化為神經(jīng)樣細胞

發(fā)布時間：2017-05-30 13:06

本文關鍵詞：依達拉奉體外定向誘導人臍帶間充質干細胞分化為神經(jīng)樣細胞，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：制備人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUMSCs),檢測其表面標志物,研究在不同濃度下依達拉奉(Edaravone)定向誘導人臍帶間充質干細胞向神經(jīng)樣細胞分化的可行性及適宜條件,探討作用機制,為進一步在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面廣泛應用奠定理論基礎,為進一步體內相關實驗研究提供實驗依據(jù)。方法：在無菌條件下選取足月健康新生兒臍帶10cm,置于H-DMEM/F12培養(yǎng)基中,放置于4℃溫箱內保存,移送至細胞培養(yǎng)室,用D-Hank's將標本中的積血完全沖洗干凈,剔除臍動脈和臍靜脈,將臍帶間質組織按照1mm3的大小分割成組織塊,用0.2%膠原酶Ⅱ消化,放入含有20%胎牛血清(FBS)、2ng/ml表皮細胞生長因子(EGF)、25mM左旋谷氨酰胺(L-Glu)、100U/ml青霉素,100μ g/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下動態(tài)觀察其形態(tài)學特征變化及增殖情況。當有約90%左右的細胞貼壁生長時,加入胰酶消化細胞、制成細胞懸液,并傳代。采用流式細胞術檢測消化細胞的細胞表型,包括CD105、CD90、CD73、 CD19、CD34、CD45、CDllb以及組織相容性抗原HLA-DR(MHC-II),用抗鼠IgG1-PE和IgG1-FITC作為同型對照。P1代細胞是指原代hUMSCs按1：1傳代后得到的細胞。在倒置顯微鏡下動態(tài)觀察細胞形態(tài)學改變,當約90%左右的細胞貼壁生長時即可進行傳代,傳代分瓶的比例一般為1：2,繪制細胞生長曲線。取正常傳代至P4代的hUMSCs,當大約有90%左右的細胞貼壁生長時,通過離心法制成細胞懸液,分別置入六孔板及25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中,共分為A、B、C、D四組,前三組作為實驗組,最后1組為對照組。A、B、C組分別加入含有依達拉奉(Edaravone)濃度依次為50mg/L、100mg/L、300mg/L的誘導液,每孔含誘導液3m1,每瓶含誘導液5m1,誘導液均用L-DMEM培養(yǎng)基配制,D組只加L-DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中誘導,倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察細胞形態(tài)學改變。分別于誘導的第1、2、4、6、12、18、24小時統(tǒng)計各組細胞變化率,繼續(xù)培養(yǎng)共24小時,采用免疫細胞化學染色檢測各標志物陽性率,各組各時點細胞陽性率,結果以x±s表示,最后選取較適合的誘導濃度。使用Western blot及RT-PCR的方法檢測較合適濃度誘導組細胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、微管相關蛋白2(MAP-2)蛋白及mRNA水平的情況。結果：原代細胞通過離心法傳代培養(yǎng)12h后,大約有60%的細胞逐漸貼壁,細胞形態(tài)為菱形、圓點形或者長梭形；隨著培養(yǎng)時間延長,貼壁的細胞數(shù)量慢慢增加,大部分細胞形態(tài)變?yōu)殚L梭形；約90%左右的細胞貼壁生長時,倒置顯微鏡鏡下觀察到細胞呈放射螺旋狀生長。當細胞融合完全時,按1：2比例繼續(xù)傳代培養(yǎng),hUCMSCs的增殖能力極其旺盛,傳代至P15代細胞均可迅速生長繁殖。通過流式細胞學技術分別檢測P3、P5和P10代hUCMSCs,表面分子標志物結果顯示各代均表達間充質干細胞標志CD73.CD90和CD105,而不表達造血干細胞標志CDllb、CD19、CD34、CD45和組織相容抗原HLA-DR。加入不同濃度Edaravone后,A組細胞1h后可見零星細胞胞體收縮,折光性增強,細胞形態(tài)變?yōu)殚L橢圓形或圓形,伸出一條或多條細長的突起,可視為神經(jīng)樣細胞；4h后神經(jīng)樣細胞約有20%,細胞伸出的突起數(shù)量變多,突起的長度及分叉的數(shù)量都有所增加,6h后神經(jīng)樣細胞約占總細胞的40%,12h后有約50%的細胞發(fā)生以上改變,相鄰細胞伸出的突起會逐漸相互交纏連接成網(wǎng)狀,24h時神經(jīng)樣細胞所占比例達到頂峰,只有少數(shù)細胞沒有變?yōu)樯窠?jīng)樣細胞,但可見少量細胞脫落；B組在加入Edaravone 1h后即可看到明顯變化,大量細胞胞體收縮,胞體兩側會伸出細長的突起,神經(jīng)樣細胞約占40%,4h時可見約70%的細胞發(fā)生這樣的變化,12h時神經(jīng)樣細胞所占比例達到頂峰,并逐漸有少量細胞開始脫落；C組細胞1h時即可見大量細胞變?yōu)樯窠?jīng)樣細胞,4h時變化的細胞達到頂峰,直至24h均保持高變化率,脫落的細胞不多。D組為對照組,連續(xù)觀察24h與添加誘導液前無明顯改變。于誘導分化12h時,通過免疫細胞化學方法檢測各組細胞的神經(jīng)標志物。A、B、C三組NSE陽性率依次為54.03±1.76%、80.87±2.03%、90.97±4.06%;Nestin的陽性率為59.64±2.38%、81.70±3.08%、92.98±3.04%：、GFAP的陽性率為53.53±2.93%、78.26±4.17%、88.27±2.36%；MAP-2為陰性,C組細胞(誘導液濃度為300mmg/L)表達各神經(jīng)細胞標志物陽性率最高且穩(wěn)定。通過RT-PCR技術檢測C組細胞Oh、2h、4h、6h、12h、24h(以空白組為Oh)的各神經(jīng)細胞標志物及內參GAPDG的表達量,計算相對表達量。GFAP的mRNA相對表達量依次為0、0、0.238±0.014、0.298±0.010、0.504±0.696、0.597±0.054；NSE的mRNA相對表達量依次為0、0.275±0.020、0.499±0.021、0.877±0.022、0.859±0.018、0.438±0.016；空白組即可微量表達Nestin, mRNA的相對表達量隨時間的延長依次為0.244±0.009、0.654±0.025、0.794±0.041、0.915±0.049、0.898±0.044、0.408±0.012；誘導前后始終未見表達MAP-2,各組各時間點均可高表達GAPDH.繼續(xù)通過Westren blot技術檢測C組細胞各時間點均神經(jīng)標志物的表達量,GFAP的蛋白相對表達量依次為0、0、0.203±0.021、0.221±0.023、0.353±0.022、0.746±0.037；NSE的蛋白相對表達量依次0、0.323±0.038、0.403±0.026、0.557±0.021、0.553±0.025、0.214±0.030：Nestin的蛋白相對表達量隨時間的延長依次0.385±0.014、0.507±0.017、0.842±0.008、0.861±0.007、0.886±0.018、0.466±0.010；未見表達MAP-2,各組各時間點均可高表達GAPDH.結論：hUMSCs作為一種能夠在體外穩(wěn)定培養(yǎng)、傳代的干細胞,P15代以內均可迅速生長繁殖,通過流式細胞技術檢分別檢測P3、P5和P10代hUCMSCs,表面分子標志物結果顯示各代均表達間充質干細胞標志CD73、CD90和CD105,而不表達造血干細胞標志CDllb、CD19、CD34、CD45和組織相容抗原HLA-DR。一定濃度下的Edaravone可以將hUCMSCs定向分化為神經(jīng)樣細胞,300mmg／L是一個較恰當?shù)恼T導濃度,經(jīng)過Edaravone誘導后的細胞可表達NSE、Nestin和GFAP,不表達MAP-2。
【關鍵詞】：依達拉奉 人臍帶間充質干細胞 神經(jīng)樣細胞 免疫細胞化學染色 Westren blot 及RT-PCR
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R741
【目錄】：