本研究采用細胞培養(yǎng)、臺盼藍染色、TUNEL和DAPI染色、MDC染色、熒光蛋白標記、RNA干擾、DNA剪切、免疫組化、Western Blot分析等細胞和分子生物學(xué)技術(shù)及方法;以PC12細胞、小鼠原代神經(jīng)元以及C57BL小鼠和SD大鼠為實驗對象;系統(tǒng)地研究了在體和/或離體PD模型中以及離體鎘染毒模型中神經(jīng)細胞凋亡及自噬異常發(fā)生機理;解析了 Akt/AMPK-mTOR和PP5/PP2A-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在神經(jīng)細胞凋亡中的作用及其調(diào)控分子機理。結(jié)果如下:1 動物PD模型大腦SNc和海馬回神經(jīng)元凋亡涉及AMPK激活和Akt失活及mTOR通路抑制MPTP注射誘導(dǎo)C57BL小鼠PD亞急性模型及魚藤酮灌胃構(gòu)建SD大鼠PD模型。采用Western Blot檢測腦組織Akt,AMPK、mTOR、Caspase-3和PARP等蛋白表達,免疫組化分析腦中SNc及海馬回神經(jīng)元TH+細胞表現(xiàn),以及DAPI和TUNLE染色評估細胞凋亡。結(jié)果顯示,MPTP和魚藤酮誘導(dǎo)PD動物模型的腦組織mTOR信號通路均抑制而Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP顯著增加;AMPKα磷酸化升高而Akt磷酸化...

【文章頁數(shù)】：247 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
縮略詞(Abbreviations)
摘要
Abstract
引言
第一部分 文獻綜述
    第一章 神經(jīng)細胞調(diào)亡及其相關(guān)神經(jīng)變性疾病的研究現(xiàn)狀
        1 細胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征
        2 細胞凋亡的分子機制
        3 細胞凋亡的生物學(xué)意義
        4 細胞凋亡的檢測方法
            4.1 顯微鏡技術(shù)
            4.2 TUNEL染色法
            4.3 Hoechst和DAPI染色法
            4.4 流式細胞分析法
            4.5 Western Blotting檢測
        5 細胞凋亡與神經(jīng)變性疾病的關(guān)系
        6 小結(jié)
        參考文獻
    第二章 神經(jīng)變性疾病體內(nèi)體外模型研究進展
        1 帕金森病模型誘導(dǎo)劑概述
            1.1 MPTP/MPP+

            1.2 6-OHDA
            1.3 魚藤酮(Rotenone)
        2 體內(nèi)、體外帕金森模型的建立
            2.1 6-OHDA誘導(dǎo)的帕金森病模型
            2.2 魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病模型
            2.3 MPTP/MPP⁺誘導(dǎo)的帕金森病模型
            2.4 基因編輯技術(shù)產(chǎn)生PD動物模型
        3 阿爾茨海默病模型誘導(dǎo)劑概述
            3.1 OKA
            3.2 Wortmannin
            3.3 Isoprenaline
            3.4 Haloperidol
            3.5 Colchicine
        4 經(jīng)典的阿爾茨海默模型建立
        5 其他神經(jīng)變性疾病模型的建立
        6 小結(jié)
        參考文獻
    第三章 神經(jīng)細胞ROS、Ca²⁺/CaMKⅡ-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與凋亡/變性發(fā)生的關(guān)系
        0 ROS調(diào)控機制及其穩(wěn)態(tài)
        1 神經(jīng)細胞ROS與凋亡/變性的關(guān)系
            1.1 神經(jīng)細胞ROS與凋亡/變性同線粒體的關(guān)系
            1.2 神經(jīng)細胞ROS與凋亡/變性關(guān)聯(lián)細胞毒性分子
            1.3 神經(jīng)細胞ROS與凋亡/變性關(guān)聯(lián)調(diào)控蛋白Bcl-2
        2 Ca²⁺/CaMKⅡmTOR的分子結(jié)構(gòu)
            2.1 Ca²⁺/CaMKⅡ的分子結(jié)構(gòu)
            2.2 mTOR的分子結(jié)構(gòu)
        3 Ca²⁺/CaMKⅡ-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)
        4 Ca²⁺/CaMKⅡ-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與凋亡/變性的關(guān)系
        5 小結(jié)
        參考文獻
    第四章 神經(jīng)細胞Akt/AMPK-mTOR信號通路作用及與凋亡/變性發(fā)生的關(guān)系
        1 Akt的分子結(jié)構(gòu)
        2 AMPK的分子結(jié)構(gòu)
        3 Akt/AMPK-mTOR信號通路
        4 神經(jīng)細胞Akt/AMPK-mTOR信號通路與凋亡/變性的關(guān)系
            4.1 神經(jīng)細胞Akt-mTOR信號與凋亡/變性
            4.2 神經(jīng)細胞AMPK-mTOR信號與凋亡/變性
        5 小結(jié)
        參考文獻
    第五章 神經(jīng)細胞PP2A/PP5-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及與凋亡/變性的關(guān)系
        1 PP2A的分子結(jié)構(gòu)
        2 PP5的分子結(jié)構(gòu)
        3 MAPK的分子結(jié)構(gòu)
        4 神經(jīng)細胞PP2A-MAPK信號與凋亡/變性
        5 神經(jīng)細胞PP5-MAPK信號與凋亡/變性
        6 小結(jié)
        參考文獻
    第六章 神經(jīng)細胞自噬與凋亡關(guān)系在神經(jīng)變性疾病發(fā)生中的作用
        1 細胞自噬的概念和過程
            1.1 細胞自噬的概念
            1.2 細胞自噬的過程
        2 神經(jīng)細胞自噬與凋亡的關(guān)系
        3 神經(jīng)細胞的自噬和凋亡與帕金森病的關(guān)系
        4 神經(jīng)細胞的自噬和凋亡與阿爾茲海默病的關(guān)系
        5 神經(jīng)細胞的自噬和凋亡與亨廷頓舞蹈病的關(guān)系
        6 神經(jīng)細胞的自噬和凋亡與肌萎縮側(cè)索硬化的關(guān)系
        7 小結(jié)
        參考文獻
第二部分 實驗研究
    第七章 動物PD模型大腦SNC和海馬回神經(jīng)元凋亡與Akt/AMPK/mTOR活性關(guān)系研究
        1 材料和方法
            1.1 主要試劑及藥品
            1.2 實驗動物來源及造模
            1.3 樣品采集和處理
            1.4 腦切片免疫組化分析
            1.5 免疫印跡(Western blot)分析
            1.6 數(shù)據(jù)分析
        2 結(jié)果
            2.1 MPTP誘導(dǎo)小鼠大腦SNc區(qū)的TH⁺細胞數(shù)目減少
            2.2 MPTP誘導(dǎo)小鼠大腦SNc區(qū)神經(jīng)元凋亡
            2.3 魚藤酮誘導(dǎo)大鼠大腦腦SNc及海馬回神經(jīng)元凋亡
            2.4 魚藤酮誘導(dǎo)大鼠紋狀體AMPK/Akt/mTOR信號通路異常涉及凋亡
        3 討論
        參考文獻
    第八章 神經(jīng)細胞PD模型Ca²⁺/CaMKⅡ轉(zhuǎn)導(dǎo)與線粒體H₂O₂交互作用抑制mTOR通路導(dǎo)致凋亡發(fā)生研究
        1 材料及方法
            1.1 主要藥品及試劑
            1.2 PC12細胞系及原代小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)
            1.3 重組腺病毒的構(gòu)建及感染
            1.4 慢病毒shRNA克隆,擴增和感染
            1.5 細胞活性分析
            1.6 DAPI和TUNEL染色
            1.7 細胞H₂O₂成像
            1.8 細胞[Ca²⁺]_i成像
            1.9 免疫印跡(Western blot)分析
            1.10 統(tǒng)計分析
        2 結(jié)果
            2.1 魚藤酮誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡關(guān)聯(lián)[Ca²⁺]_i升高
            2.2 魚藤酮通過Ca²⁺介導(dǎo)mTOR通路抑制引發(fā)神經(jīng)細胞凋亡
            2.3 魚藤酮誘導(dǎo)神經(jīng)細胞Ca²⁺依賴的CaMKⅡ磷酸化介導(dǎo)mTOR通路抑制和凋亡
            2.4 魚藤酮引發(fā)Ca²⁺-CaMKⅡ依賴性地誘導(dǎo)神經(jīng)細胞H₂O₂過量產(chǎn)生
            2.5 魚藤酮誘導(dǎo)線粒體H₂O₂依賴性的[Ca²⁺]_i升高激活CaMKⅡ致mTOR抑制及神經(jīng)細胞凋亡
            2.6 過表達mTOR、持續(xù)激活S6K1和下調(diào)4E-BP1表達降低魚藤酮誘導(dǎo)[Ca²⁺]_i升高介導(dǎo)CaMKⅡ磷酸化和神經(jīng)細胞凋亡
        3 討論
        參考文獻
    第九章 神經(jīng)細胞PD模型自噬抑制涉及不依賴mTOR通路的AMPK激活機制
        1 材料及方法
            1.1 主要藥品及試劑
            1.2 PC12細胞系及原代小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)
            1.3 腺病毒的構(gòu)建與感染細胞
            1.4 細胞免疫熒光染色
            1.5 MDC染色
            1.6 GFP-LC3分析
            1.7 免疫印跡(Western blot)分析
            1.8 統(tǒng)計分析
        2 結(jié)果
            2.1 PD細胞模型中α-Synuclein增加和自噬抑制
            2.2 PD細胞模型中AMPK激活關(guān)聯(lián)mTOR信號通路和自噬抑制
        3 討論
        參考文獻
    第十章 神經(jīng)細胞PD模型中阻斷的Ulk1-Beclin 1及Atg5-Atg12途徑抑制自噬分子機理研究
        1 材料及方法
            1.1 主要藥品及試劑
            1.2 PC12細胞系及原代小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)
            1.3 構(gòu)建Ulk1敲除的PC12細胞
            1.4 mCherry-GFP-LC3分析
            1.5 免疫印跡(Western blot)和Co-IP分析
            1.6 統(tǒng)計分析
        2 結(jié)果
            2.1 PD細胞模型中Ulk1和Beclin 1活性抑制
            2.2 PD細胞模型中Beclin 1釋放/活化受阻
            2.3 敲除Ulk1強化PD毒物引發(fā)的神經(jīng)細胞Beclin 1活化受阻
            2.4 PD細胞模型中Atg5-Atg12復(fù)合物形成受阻關(guān)聯(lián)自噬抑制
        3 討論
        參考文獻
    第十一章 白藜蘆醇保護抗鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡實驗研究
        1 材料及方法
            1.1 主要藥品和試劑
            1.2 PC12細胞系及原代小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)
            1.3 細胞形態(tài)學(xué)觀察和活性分析
            1.4 DAPI和TUNEL染色
            1.5 免疫印跡(Western blot)分析
            1.6 統(tǒng)計分析
        2 結(jié)果
            2.1 白藜蘆醇削弱鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細胞活性下降和形態(tài)學(xué)變化
            2.2 白藜蘆醇抵抗鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡
        3 討論
        參考文獻
    第十二章 白藜蘆醇通過抑制mTORC1和mTORC2信號通路抗鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡分子機理研究
        1 材料及方法
            1.1 主要藥品和試劑
            1.2 實驗動物
            1.3 PC12細胞系及原代小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)
            1.4 重組腺病毒的構(gòu)建和細胞感染
            1.5 慢病毒shRNA設(shè)計,構(gòu)建和感染
            1.6 細胞活性分析
            1.7 TUNEL染色
            1.8 免疫印跡(Western blot)分析
            1.9 統(tǒng)計分析
        2 結(jié)果
            2.1 下調(diào)mTOR增強白藜蘆醇抑制鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡
            2.2 mTORC1和mTORC2通路涉及白藜蘆醇抗鎘神經(jīng)毒性發(fā)揮保護作用
            2.3 白藜蘆醇通過靶向mTORC1介導(dǎo)S6K1途徑抗鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡
            2.4 白藜蘆醇通過靶向mTORC1介導(dǎo)4E-BP1途徑抗鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡
            2.5 白藜蘆醇通過靶向mTORC2介導(dǎo)Akt途徑抗鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡
        3 討論
        參考文獻
    第十三章 白藜蘆醇通過PP2A和PP5抑制鎘激活Erk1/2和JNK通路抗神經(jīng)細胞凋亡分子機理研究
        1 材料及方法
            1.1 主要藥品和試劑
            1.2 PC12細胞系及原代小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)
            1.3 重組腺病毒的構(gòu)建和感染
            1.4 臺盼藍染色活細胞分析
            1.5 DAPI染色
            1.6 免疫印跡(Western blot)分析
            1.7 統(tǒng)計分析
        2 結(jié)果
            2.1 白藜蘆醇通過阻滯鎘激活JNK和Erk1/2通路抗神經(jīng)細胞凋亡
            2.2 鈍化c-Jun或MKK1表達增強白藜蘆醇抗鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡
            2.3 白藜蘆醇營救Cd抑制的神經(jīng)細胞PP2A和PP5活性
            2.4 過表達PP2A提高白藜蘆醇抑制鎘誘導(dǎo)JNK、Erk1/2和p38激活和神經(jīng)細胞凋亡
            2.5 過表達PP5增強Res抑制Cd誘導(dǎo)JNK,Erk1/2活化及抗神經(jīng)細胞凋亡
        3 討論
        參考文獻
第三部分 全文結(jié)論
    全文結(jié)論
附1 攻讀博士學(xué)位期間研究成果及獲獎情況
致謝



本文編號：3979131

boshi