本文關(guān)鍵詞：HSPA12A在缺血性腦卒中保護作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景和目的：腦缺血損傷,又稱腦梗塞、腦卒中,是世界上死亡率第一、致殘率第三的重大疾病。尋求新的保護腦缺血的基因并充分利用其改善腦缺血損傷功能,一直是我們亟待解決的重要任務(wù)。熱休克蛋白是機體在受到不良環(huán)境因素刺激后大量產(chǎn)生并發(fā)揮重要作用的一組應(yīng)激蛋白質(zhì)A12A(HSPA12A)是一種新發(fā)現(xiàn)的熱休克蛋白,屬于HSP70家族中的一員。研究表明,HSPA12A轉(zhuǎn)錄本在哺乳動物腦組織中含量非常豐富,但其在腦組織中的作用卻沒有過相關(guān)研究。因此我們課題組通過構(gòu)建hspal2a基因條件性敲除(Conditional knockout, cKO)小鼠以及制備腦缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion, I/R)模型,研究HSPA12A是否參與腦I/R后的修復(fù)以及其在腦I/R后修復(fù)中所起的作用,以期為腦卒中的診斷和治療提供一定的理論參考依據(jù)。方法采用hspal2a基因條件性敲除的小鼠為實驗對象,通過構(gòu)建腦i/R損傷模型,觀察、比較小鼠I/R損傷后HSPA12A表達量的變化以及hspal2a基因缺失對小鼠腦I/R損傷的影響,從而探索HSPA12A在腦組織中的病理生理作用。1. HSPA12A蛋白的定位：采用免疫熒光法(Immunofluorescence, IF),將HSPA12A分別與神經(jīng)元標記蛋白NeuN、β-TublinⅢ共染。2. HSPA12A在腦I/R后的水平變化：(1)動物水平上,采用拴線穿過小鼠左頸內(nèi)動脈堵住大腦中動脈,缺血1 h,再灌注不同時間來誘導(dǎo)I/R模型。(2)在細胞水平上,通過將原代神經(jīng)元細胞換入無糖培養(yǎng)基并放入乏氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后,重新恢復(fù)正常培養(yǎng)24 h來誘導(dǎo)氧糖剝奪/復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)模型。收集細胞,通過蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot, WB)以及實時定量PCR (Real time polymerase chain reaction, RT-PCR),分別檢測HSPA12A的蛋白與mRNA表達量的變化情況。3.實驗動物模型的構(gòu)建：本課題組與南京大學(xué)模式動物研究合作,采用Cre-loxp系統(tǒng),構(gòu)建hspal2a條件性基因敲除小鼠,后者與Cre轉(zhuǎn)基因鼠交配,得到spal2a基因敲除鼠。4.hspal2a基因敲除鑒定：(1)用聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)確定小鼠的基因型；(2)用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測小鼠腦組織中HSPA12A蛋白表達水平；(3)用實時定量PCR測小鼠腦組織中HSPA12AmRNA的表達量；(4)免疫熒光染色檢測HSPA12A蛋白熒光。5.腦I/R損傷程度的評定：(1)梗死面積：經(jīng)過缺血1 h/再灌24 h后,取腦組織,均勻切成5片,用2%的氯化三苯基四氮唑(Triphenyltetrazolium Chloride, TTC)染色,拍攝圖片后統(tǒng)計梗死面積。(2)神經(jīng)行為學(xué)評分：經(jīng)過缺血1 h/再灌24 h后,通過觀察小鼠精神狀態(tài)、運動強度、觸須反應(yīng)、平衡度、對稱性五項指標綜合評分。(3)海馬神經(jīng)元損傷：缺血1 h/再灌24 h后,取腦組織經(jīng)固定、包埋后制成石蠟切片,經(jīng)過蘇木精—伊紅(HemotoxylinEosin Staining, HE)染色和尼氏(Nissl)染色后,觀察比較海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化。(4)神經(jīng)元凋亡：缺血1h/再灌24h后,取腦組織制備石蠟切片后,采用TUNEL法染色,拍攝圖片后統(tǒng)計凋亡細胞百分比。以及缺血1h/再灌3h后,免疫印跡法測定腦組織中促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的表達水平。6.統(tǒng)計學(xué)分析：使用SPSS17.0進行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以平均值±標準差(χ±SD)表示,兩組數(shù)據(jù)之間用均數(shù)檢驗(t檢驗),多組數(shù)據(jù)之間用單因素方差分析(ANOVA),P0.05表示有顯著性差異。實驗結(jié)果1. HSPA12A蛋白在小鼠腦組織中表達最高,且表達在神經(jīng)元中。2. HSPA12A在I/R的腦組織、氧糖剝奪/復(fù)氧后的神經(jīng)元中表達下降。3. Hspa12a基因缺失擴大腦I/R引起的腦梗塞面積。4. Hspa12a基因缺失加劇腦I/R引起的神經(jīng)功能障礙。5. Hspa12a基因缺失加重腦I/R導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元損傷。6. Hspa12a基因缺失促進腦I/R后神經(jīng)細胞的凋亡。結(jié)論HSA12A在神經(jīng)元細胞中表達,且參與腦I/R損傷過程,在維護腦I/R后的損傷修復(fù)中具有重要作用。
【關(guān)鍵詞】：熱休克蛋A12A 腦缺血/再灌注 神經(jīng)元損傷
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743.3
【目錄】：

• 英文縮寫和略語3-4
• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-11
• 材料與方法11-23
• 1. 實驗材料11-14
• 2. 實驗方法14-23
• 結(jié)果23-34
• 討論34-38
• 參考文獻38-44
• 綜述 熱休克蛋白在腦組織中的保護作用44-49
• 摘要44
• 1. 引言44-45
• 2. 熱休克蛋白的分類及其生物學(xué)特征45
• 3. 熱休克蛋白的可能調(diào)節(jié)機制45-48
• 4. 展望48-49
• 研究生期間發(fā)表的文章49-50
• 致謝50

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