本文關(guān)鍵詞：S-烯丙基半胱氨酸激活Nrf2-ARE信號通路對缺血性腦卒中的保護(hù)作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[研究背景]缺血性腦卒中嚴(yán)重危害人類健康,是目前繼心血管病之后的第二大死因。越來越多的研究表明,氧化應(yīng)激在腦缺血發(fā)病中占據(jù)重要地位,減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)是腦缺血的一個重要治療策略。Nrf2 (nuclear transcription factor NF-E2-related factor 2)是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的重要轉(zhuǎn)錄因子。作為內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)因子,Nrf2能誘導(dǎo)一系列細(xì)胞保護(hù)基因和解毒基因的表達(dá)。在對抗氧化應(yīng)激損傷方面具有很大潛力。Nrf2轉(zhuǎn)移入核后可啟動受ARE調(diào)控的下游基因如血紅蛋白氧合酶(hemeoxygenase, HO-1)、谷胱甘肽半胱氨酸連接酶催化亞基(glutathione cysteine ligase regulatory subunit, GCLC)、谷胱甘肽半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)亞基(glutathione cysteine ligase modulatory subunit, GCLM)等的轉(zhuǎn)錄,從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。眾多的證據(jù)表明,Nrf2-ARE (antioxidant response element)通路在缺血／再灌注腦損傷的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用,是腦缺血發(fā)生發(fā)展過程中重要的調(diào)控靶點(diǎn)。尋找新型高效的Nrf2誘導(dǎo)劑可為腦缺血的治療提供新的有效候選藥物。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),大蒜中含有的有機(jī)硫成分S-烯丙基半胱氨酸(S-allyl cysteine, SAC)為強(qiáng)Nrf2誘導(dǎo)劑,初步的細(xì)胞實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)該化合物可保護(hù)OGD(oxygen and glucose deprivation)所致原代皮層神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷,且此保護(hù)作用與Nrf2-ARE通路誘導(dǎo)密切相關(guān)。本研究通過OGD損傷原代皮層神經(jīng)元模型及C57BL/6小鼠腦缺血模型,分別從體內(nèi)體外研究該化合物對OGD所致腦缺血細(xì)胞及動物模型的保護(hù)作用及機(jī)制,從抗氧化角度闡明其作用機(jī)理。為腦缺血的治療提供一種新策略,為篩選Nrf2-ARE通路誘導(dǎo)劑治療缺血性腦血管疾病提供新思路和途徑。[研究目的]研究SAC通過調(diào)節(jié)Nrf2-ARE信號通路對缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。[研究方法]體外實驗：1.在原代皮層神經(jīng)元中給予不同濃度的SAC干預(yù)8h和24 h以及選擇50μM的SAC作用于神經(jīng)元不同時間后,Western blot法檢測Nrf2蛋白表達(dá)以及下游蛋白(GCLC,GCLM, HO-1)的表達(dá)水平；用電泳遷移率的方法檢測Nrf2-DNA結(jié)合活性。觀察SAC是否激活Nrf2-ARE信號通路。2.在原代皮層神經(jīng)元中給予不同濃度的SAC干預(yù)2h后,采用糖氧剝奪(OGD)損傷60 min再灌注24h。用MTT法檢測細(xì)胞存活率,化學(xué)顯色法檢測乳酸脫氫酶(LDH)漏出率,Hoechst33258和Tunel染色檢測細(xì)胞凋亡水平。觀察SAC對OGD誘導(dǎo)原代皮層神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。用Western blot法檢測凋亡通路各蛋白(p-JNK, p-p38, caspase-3)的表達(dá)水平,觀察SAC能否阻斷OGD所致JNK/p38凋亡信號通路的激活。3. shRNA干擾Nrf2表達(dá),然后給予SAC (50 μM)干預(yù),8h和24 h后用Western blotting法檢測Nrf2及下游蛋白(HO-1,GCLC,GCLM)的表達(dá)水平。檢測Nrf2被干擾后SAC是否還可以激活Nrf2-ARE通路。另外,shRNA干擾Nrf2表達(dá),SAC (50 μM)干預(yù)2h,OGD損傷60 min,培養(yǎng)24 h后采用MTT法和LDH法檢測細(xì)胞的存活率及Hoechst33258染色觀察細(xì)胞發(fā)生凋亡的情況。檢測Nrf2被干預(yù)后,SAC的保護(hù)作用是否還存在,以驗證SAC的保護(hù)作用是否通過激活Nrf2-ARE通路實現(xiàn)。體內(nèi)實驗：1.野生型小鼠(Nrf2+/+)和Nrf2敲基因小鼠(Nrf2-/-)腹腔注射SAC (300 mg/kg) 30 min后,MCAO法制備局灶性腦缺血再灌注損傷模型,再灌注24h后取小鼠腦組織,免疫組化法觀察Nrf2在皮層和海馬中的分布情況；Western blot法檢測Nrf2和下游蛋白(GCLC, GCLM,HO-1)在皮層和海馬中的表達(dá)水平。2. MCAO法制備小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型,采用TTC染色法觀察腦梗死面積,神經(jīng)病學(xué)評分觀察小鼠的行為學(xué)變化,HE和Nissl染色觀察皮層和海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化。3.制備MCAO模型前30 min,腹腔注射SAC (300 mg/kg),缺血再灌注24 h后,將小鼠麻醉處死,取小鼠全腦或皮層和海馬。用TUNEL染色法檢測小鼠皮層和海馬凋亡細(xì)胞數(shù)的變化,Western blotting法檢測凋亡信號通路各蛋白(p-JNK, p-p38, caspase-3)表達(dá)情況。檢測SAC是否可阻斷MCAO所致JNK/p38凋亡信號通路的激活。[實驗結(jié)果]1.在原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中SAC可呈劑量和時間相關(guān)性的誘導(dǎo)Nrf2蛋白表達(dá),并促進(jìn)Nrf2下游蛋白(GCLC, GCLM, HO-1)的表達(dá)。2.對原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元進(jìn)行OGD損傷后,SAC能夠增加細(xì)胞存活率,減少乳酸脫氫酶釋放量,減少凋亡細(xì)胞數(shù)目,可阻斷p-JNK, p-p38誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。3.采用shRNA將原代皮層神經(jīng)元中Nrf2阻斷后,SAC干預(yù)組中Nrf2及下游基因(GCLC, GCLM, HO-1)的表達(dá)不再升高；SAC的保護(hù)作用明顯被阻斷,表明SAC是通過Nrf2依賴的方式來保護(hù)神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激損傷。4.SAC可誘導(dǎo)野生型小鼠(Nrf2+/+)皮層和海馬Nrf2及其下游蛋白(GCLC, GCLM, HO-1)的表達(dá),而對敲基因小鼠(Nrf2-/-)在IR, IR+SAC兩組中Nrf2以及下游蛋白(GCLC, GCLM, HO-1)的表達(dá)相對Sham組來說無明顯差異。5.對野生型小鼠(Nrf2+/+)給予SAC后腦梗死面積明顯減少,而對敲基因小鼠(Nrf2-/-)腦梗死面積在IR, IR+SAC兩組無差異且都較野生型小鼠嚴(yán)重；野生型小鼠(Nrf2+/+)給予SAC后皮層和海馬中細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生了明顯改善,而對敲基因小鼠(Nrf2-/-)皮層和海馬部位凋亡細(xì)胞數(shù)在IR, IR+SAC兩組無差異且都較野生型小鼠增多。6.在野生型小鼠(Nrf2+/+)中,SAC干預(yù)組能明顯減少細(xì)胞凋亡數(shù)目以及明顯降低凋亡信號通路各蛋白(p-JNK, p-p38, caspase-3)的表達(dá)；而在敲基因小鼠(Nrf2-/-)中SAC的這種保護(hù)作用消失。[結(jié)論]SAC對OGD誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷以及小鼠腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用,此保護(hù)作用通過激活Nrf2-ARE信號通路實現(xiàn)。
【關(guān)鍵詞】：SAC 腦缺血 Nrf2 氧化應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743.3
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 符號說明14-16
• 前言16-19
• 實驗材料19-24
• 實驗方法24-40
• 實驗結(jié)果40-45
• 討論45-49
• 結(jié)論49-50
• 附表及附圖50-67
• 參考文獻(xiàn)67-71
• 致謝71-72
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及獲獎目錄72-73
• 附件73

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本文編號：389790