本文關(guān)鍵詞：肌肉營(yíng)養(yǎng)不良蛋白聚糖DG與Sedlin蛋白的相互作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的本研究旨在證明肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白聚糖DG是否與Sedlin蛋白之間存在相互作用,以及進(jìn)一步探尋DG中與Sedlin存在相互作用的具體結(jié)構(gòu)域。并依次應(yīng)用了質(zhì)粒構(gòu)建、酵母雙雜交、免疫印跡、GST Pulldown、間接免疫熒光以及免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)技術(shù),分別從酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及體外三個(gè)層面對(duì)此加以證實(shí),為探索DG蛋白和Sedlin蛋白的功能奠定一定的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。方法在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中,我們依次構(gòu)建DG的酵母表達(dá)質(zhì)粒p GΑDT7-DAG1,p GBKT7-DΑG1,并分別與本實(shí)驗(yàn)室保存的Sedlin的酵母表達(dá)質(zhì)粒p GBKT7-SEDL,p GΑDT7-SEDL共同轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞(ΑH109)中,然后在SD3-(-Leu/-His/-Trp)培養(yǎng)基上進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)篩選,并對(duì)生長(zhǎng)出的克隆進(jìn)行α-半乳糖苷酶(X-α-gαl)活性測(cè)定,通過(guò)觀察克隆是否變藍(lán)來(lái)證明DG是否與Sedlin存在相互作用。然后我們繼續(xù)構(gòu)建pc DNΑ3.1-DΑG1-FLΑG真核表達(dá)質(zhì)粒。在GST Pulldown實(shí)驗(yàn)中,將pc DNΑ3.1-DΑG1-FLΑG單獨(dú)轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞(HEK 293T),然后提取細(xì)胞總蛋白,與本實(shí)驗(yàn)室保存的GST-Sedlin融合蛋白在體外混懸,收集谷胱甘肽珠子進(jìn)行免疫印跡分析證明DG是否與Sedlin存在相互作用。在間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)中,將pc DNΑ3.1-DΑG-FLΑG和pc DGFP-SEDL共同轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中(COS7),進(jìn)行免疫熒光制片,通過(guò)熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察DG是否與Sedlin存在共定位現(xiàn)象。在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中,將pc DNΑ3.1-DΑG1-FLΑG和pc DGFP-SEDL共同轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中(HEK 293T),提取細(xì)胞總蛋白,利用FLAG抗體孵育和瓊脂糖珠沉淀后,收集珠子進(jìn)行免疫印跡分析證明DG是否與Sedlin存在相互作用。接下來(lái),我們又利用了上述同樣的實(shí)驗(yàn)方法,進(jìn)一步研究了DG的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(α-DG和β-DG)與Sedlin之間的相互作用情況。結(jié)果酶切鑒定結(jié)果和測(cè)序結(jié)果一致證明所需質(zhì)粒構(gòu)建成功。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)顯示,共同表達(dá)了DG和Sedlin兩種蛋白的酵母細(xì)胞在SD3-培養(yǎng)基中能夠正常生長(zhǎng),且克隆在進(jìn)行α-半乳糖苷酶(X-α-gαl)活性測(cè)定后顏色變藍(lán),即證明二者存在相互作用。GST Pulldown實(shí)驗(yàn)顯示,當(dāng)用FLAG抗體免疫印跡后,實(shí)驗(yàn)組(GST-Sedlin+DG-FLΑG)能夠檢測(cè)到DG的存在,表明GST-Sedlin融合蛋白在體外條件下能夠下拉DG蛋白,則證明二者存在相互作用。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示,DG在COS 7細(xì)胞主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,而Sedlin在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有分布,且二者在細(xì)胞質(zhì)中存在明顯的共定位現(xiàn)象。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示,當(dāng)用GFP抗體免疫印跡后,實(shí)驗(yàn)組(Sedlin-GFP+DG-FLΑG)中能夠檢測(cè)到Sedlin-GFP的存在,表明FLAG抗體在沉淀DG-FLΑG的同時(shí)也將Sedlin-GFP共同沉淀下來(lái),即證明二者存在相互作用。在進(jìn)一步的研究中,GST-Sedlin融合蛋白在體外條件下也能下拉α-DG和β-DG蛋白;且α-DG和β-DG與Sedlin在COS 7的細(xì)胞質(zhì)中也都存在共定位現(xiàn)象;且FLAG抗體在沉淀α-DG和β-DG的同時(shí)也能將Sedlin共沉淀下來(lái),這一致表明α-DG和β-DG都與Sedlin存在相互作用。結(jié)論通過(guò)酵母雙雜交、GST下拉技術(shù)、間接免疫熒光、免疫共沉淀等四種技術(shù)充分證實(shí)了肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白聚糖DG和Sedlin蛋白在酵母細(xì)胞中、哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以及體外實(shí)驗(yàn)中都存在相互作用,且DG的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,即α-DG和β-DG都能與Sedlin蛋白存在相互作用,為進(jìn)一步研究它們之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白聚糖 酵母雙雜交 免疫熒光 免疫共沉淀
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R746.2
【目錄】：

• 英文縮略表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 1 引言11-13
• 2 材料與方法13-39
• 3 結(jié)果39-52
• 4 討論52-56
• 5 結(jié)論56
• 6 對(duì)本課題的進(jìn)一步研究56-57
• 7 參考文獻(xiàn)57-62
• 附錄62-64
• 致謝64-65
• 綜述65-77
• 參考文獻(xiàn)72-77

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 巨紅妹;張霞;王云華;;新型蛋白標(biāo)簽在分子生物學(xué)中的應(yīng)用[J];中國(guó)病原生物學(xué)雜志;2011年08期

  本文關(guān)鍵詞：肌肉營(yíng)養(yǎng)不良蛋白聚糖DG與Sedlin蛋白的相互作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：388091