本文關鍵詞：肌肉營養(yǎng)不良蛋白聚糖DG與Sedlin蛋白的相互作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的本研究旨在證明肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖DG是否與Sedlin蛋白之間存在相互作用,以及進一步探尋DG中與Sedlin存在相互作用的具體結構域。并依次應用了質(zhì)粒構建、酵母雙雜交、免疫印跡、GST Pulldown、間接免疫熒光以及免疫共沉淀等實驗技術,分別從酵母細胞、哺乳動物細胞以及體外三個層面對此加以證實,為探索DG蛋白和Sedlin蛋白的功能奠定一定的細胞學基礎。方法在酵母雙雜交實驗中,我們依次構建DG的酵母表達質(zhì)粒p GΑDT7-DAG1,p GBKT7-DΑG1,并分別與本實驗室保存的Sedlin的酵母表達質(zhì)粒p GBKT7-SEDL,p GΑDT7-SEDL共同轉化至酵母細胞(ΑH109)中,然后在SD3-(-Leu/-His/-Trp)培養(yǎng)基上進行營養(yǎng)篩選,并對生長出的克隆進行α-半乳糖苷酶(X-α-gαl)活性測定,通過觀察克隆是否變藍來證明DG是否與Sedlin存在相互作用。然后我們繼續(xù)構建pc DNΑ3.1-DΑG1-FLΑG真核表達質(zhì)粒。在GST Pulldown實驗中,將pc DNΑ3.1-DΑG1-FLΑG單獨轉染到哺乳動物細胞(HEK 293T),然后提取細胞總蛋白,與本實驗室保存的GST-Sedlin融合蛋白在體外混懸,收集谷胱甘肽珠子進行免疫印跡分析證明DG是否與Sedlin存在相互作用。在間接免疫熒光實驗中,將pc DNΑ3.1-DΑG-FLΑG和pc DGFP-SEDL共同轉染到哺乳動物細胞中(COS7),進行免疫熒光制片,通過熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察DG是否與Sedlin存在共定位現(xiàn)象。在免疫共沉淀實驗中,將pc DNΑ3.1-DΑG1-FLΑG和pc DGFP-SEDL共同轉染到哺乳動物細胞中(HEK 293T),提取細胞總蛋白,利用FLAG抗體孵育和瓊脂糖珠沉淀后,收集珠子進行免疫印跡分析證明DG是否與Sedlin存在相互作用。接下來,我們又利用了上述同樣的實驗方法,進一步研究了DG的兩個結構域(α-DG和β-DG)與Sedlin之間的相互作用情況。結果酶切鑒定結果和測序結果一致證明所需質(zhì)粒構建成功。酵母雙雜交實驗顯示,共同表達了DG和Sedlin兩種蛋白的酵母細胞在SD3-培養(yǎng)基中能夠正常生長,且克隆在進行α-半乳糖苷酶(X-α-gαl)活性測定后顏色變藍,即證明二者存在相互作用。GST Pulldown實驗顯示,當用FLAG抗體免疫印跡后,實驗組(GST-Sedlin+DG-FLΑG)能夠檢測到DG的存在,表明GST-Sedlin融合蛋白在體外條件下能夠下拉DG蛋白,則證明二者存在相互作用。間接免疫熒光實驗顯示,DG在COS 7細胞主要分布在細胞質(zhì)中,而Sedlin在細胞質(zhì)和細胞核中都有分布,且二者在細胞質(zhì)中存在明顯的共定位現(xiàn)象。免疫共沉淀實驗顯示,當用GFP抗體免疫印跡后,實驗組(Sedlin-GFP+DG-FLΑG)中能夠檢測到Sedlin-GFP的存在,表明FLAG抗體在沉淀DG-FLΑG的同時也將Sedlin-GFP共同沉淀下來,即證明二者存在相互作用。在進一步的研究中,GST-Sedlin融合蛋白在體外條件下也能下拉α-DG和β-DG蛋白;且α-DG和β-DG與Sedlin在COS 7的細胞質(zhì)中也都存在共定位現(xiàn)象;且FLAG抗體在沉淀α-DG和β-DG的同時也能將Sedlin共沉淀下來,這一致表明α-DG和β-DG都與Sedlin存在相互作用。結論通過酵母雙雜交、GST下拉技術、間接免疫熒光、免疫共沉淀等四種技術充分證實了肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖DG和Sedlin蛋白在酵母細胞中、哺乳動物細胞中以及體外實驗中都存在相互作用,且DG的兩個結構域,即α-DG和β-DG都能與Sedlin蛋白存在相互作用,為進一步研究它們之間的關系奠定了基礎。
【關鍵詞】：肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖 酵母雙雜交 免疫熒光 免疫共沉淀
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R746.2
【目錄】：

• 英文縮略表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 1 引言11-13
• 2 材料與方法13-39
• 3 結果39-52
• 4 討論52-56
• 5 結論56
• 6 對本課題的進一步研究56-57
• 7 參考文獻57-62
• 附錄62-64
• 致謝64-65
• 綜述65-77
• 參考文獻72-77

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 巨紅妹;張霞;王云華;;新型蛋白標簽在分子生物學中的應用[J];中國病原生物學雜志;2011年08期

  本文關鍵詞：肌肉營養(yǎng)不良蛋白聚糖DG與Sedlin蛋白的相互作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：388091