發(fā)布時(shí)間：2017-05-21 21:21

  本文關(guān)鍵詞：UCH-L1對HDAC6介導(dǎo)的tau蛋白功能性聚集體形成的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：泛素-蛋白酶體途徑和自噬-溶酶體途徑是細(xì)胞內(nèi)降解異常蛋白質(zhì)的主要途徑,它們監(jiān)測、調(diào)控胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變化,并能及時(shí)清除異常蛋白質(zhì)。與tau蛋白相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病常表現(xiàn)為tau蛋白的異常修飾和在胞內(nèi)的大量聚集,并且伴隨著泛素-蛋白酶體降解途徑功能障礙,不能有效清除胞內(nèi)異常蛋白質(zhì),同時(shí)UCH-L1也會(huì)發(fā)生功能障礙。此時(shí),自噬-溶酶體途徑的活性會(huì)增加,異常蛋白質(zhì)降解的代償性途徑發(fā)揮降解異常蛋白質(zhì)功能。自噬-溶酶體途徑不僅需要HDAC6、p62和動(dòng)力蛋白等蛋白質(zhì)分子,還需要ataxin3和Pohl等去泛素化酶的參與。并且,HDAC6也可以與去泛素化酶UCH-L1結(jié)合,但UCH-L1的具體作用以及是否會(huì)影響自噬-溶酶體途徑尚未得知。本實(shí)驗(yàn)中,首先誘導(dǎo)HEK293/tau441細(xì)胞產(chǎn)生去泛素化酶UCH-L1表達(dá)異常和蛋白酶體功能障礙,即采用UCH-L1 siRNA抑制UCH-L1表達(dá)后,同時(shí)用2 μM的MG132處理HEK293/tau441細(xì)胞24r。隨后采用Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)HDAC6和總tau蛋白含量的變化情況,用免疫沉淀檢測HDAC6與泛素化tau蛋白結(jié)合的變化情況,以及用免疫熒光檢測實(shí)驗(yàn)處理后各處理組tau蛋白功能性聚集體的形成情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：(1)與對照組相比,UCH-L1 siRNA能抑制UCH-L1表達(dá)(抑制率為75%)；用MG132處理后,發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)HDAC6和總tau蛋白水平增加；(2)UCH-L1 siRNA和MG132同時(shí)處理細(xì)胞,與MG132組相比,HDAC6表達(dá)下調(diào),總tau蛋白含量上升；(3)免疫沉淀結(jié)果顯示,與對照組相比,MG132處理后,細(xì)胞內(nèi)多聚泛素含量增加,泛素化tau蛋白含量增多,HDAC6與泛素的結(jié)合增加；(4)免疫沉淀結(jié)果顯示抑制UCH-L1正常表達(dá)并抑制蛋白酶體活性后,與MG132實(shí)驗(yàn)組相比,細(xì)胞內(nèi)泛素化tau蛋白含量繼續(xù)增加,然而,HDAC6和泛素的結(jié)合下降；(5)免疫沉淀結(jié)果顯示,與對照組相比,MG132處理后,胞內(nèi)HDAC6與tau-5結(jié)合顯著增加,同時(shí)抑制UCH-L1表達(dá)后,HDAC6與tau-5結(jié)合也表現(xiàn)為增加,但與MG132組相比表現(xiàn)為顯著下降；(6)免疫熒光結(jié)果顯示,MG132處理則能促使細(xì)胞內(nèi)形成明顯的tau蛋白聚集體結(jié)構(gòu),但是UCH-L1表達(dá)下降并抑制蛋白酶體活性后,tau蛋白雖然表現(xiàn)出一定的聚集趨勢,但未能形成功能性聚集體結(jié)構(gòu)。結(jié)論：上述結(jié)果表明蛋白酶體活性被MG132抑制后,胞內(nèi)異常tau蛋白會(huì)形成聚集體經(jīng)自噬-溶酶體途徑降解,以減少對細(xì)胞的毒性作用；若同時(shí)抑制去泛素化酶UCH-L1表達(dá)、使其功能降低,會(huì)限制細(xì)胞內(nèi)聚集體的形成,進(jìn)而影響自噬途徑的順利進(jìn)行和異常蛋白質(zhì)的清除。本實(shí)驗(yàn)為UCH-L1參與自噬-溶酶體途徑提供依據(jù),為神經(jīng)退行性疾病治療提供新的靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：泛素碳末端水解酶L1 組蛋白去乙�；�6 泛素 tau蛋白聚集體 自噬-溶酶體途徑
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R3411
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 文中主要縮略詞簡表10-13
• 1 前言13-23
• 1.1 蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)13-16
• 1.2 泛素碳末端水解酶L1—UCH-L116-17
• 1.3 組蛋白去乙酰化酶6結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能17-20
• 1.4 微管相關(guān)蛋白tau及其生物學(xué)功能20-22
• 1.5 研究目的和意義22-23
• 2 材料與方法23-31
• 2.1 主要試劑和抗體23
• 2.1.1 主要試劑23
• 2.1.2 抗體23
• 2.2 主要儀器23-24
• 2.3 細(xì)胞培養(yǎng)24-25
• 2.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)處理25-26
• 2.4.1 UCH-L1 siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)25-26
• 2.4.2 加藥處理26
• 2.5 免疫印跡(Western blotting,WB)26-28
• 2.5.1 收集蛋白樣品(冰上操作)26-27
• 2.5.2 BCA法測蛋白濃度(冰上操作)27
• 2.5.3 免疫印跡27-28
• 2.6 免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)(低溫工作室中操作)28-29
• 2.7 免疫熒光(Immunofluorescence,IF)29-30
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析30-31
• 3 結(jié)果31-38
• 3.1 不同濃度的UCH-L1 siRNA轉(zhuǎn)染處理對UCH-L1表達(dá)水平的影響31-32
• 3.2 蛋白酶體活性抑制時(shí),抑制UCH-L1表達(dá)HDAC6含量下降32
• 3.3 蛋白酶體活性抑制時(shí),抑制UCH-L1表達(dá)總tau含量增加32-33
• 3.4 蛋白酶體活性抑制時(shí),抑制UCH-L1表達(dá)HDAC6與泛素結(jié)合力下降33-34
• 3.5 蛋白酶體活性抑制時(shí),抑制UCH-L1表達(dá)泛素化tau蛋白增加34-35
• 3.6 蛋白酶體活性抑制時(shí),抑制UCH-L1表達(dá)HDAC6與tau蛋白的結(jié)合下降35-36
• 3.7 蛋白酶體活性抑制時(shí),UCH-L1對tau蛋白聚集體形成的影響36-38
• 4 討論38-43
• 4.1 UCH-L1表達(dá)下調(diào)對HDAC6含量的影響39-40
• 4.2 UCH-L1表達(dá)下調(diào)對胞內(nèi)tau蛋白含量的影響40
• 4.3 UCH-L1表達(dá)下調(diào)影響tau、HDAC6和泛素三者之間的結(jié)合40-41
• 4.4 UCH-L1表達(dá)下調(diào)影響tau蛋白聚集體的形成41-43
• 5 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-54
• 附錄54-55
• 致謝55-56

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 馬祖祥;趙維玲;李永柏;高曉潔;楊軍;孫平;李成榮;;特發(fā)性腎病綜合征患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞泛素的表達(dá)及意義[J];中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志;2006年10期

2 王素霞;劉媛;吳慧娟;張志剛;;去泛素化酶的研究及其進(jìn)展[J];臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志;2008年06期

3 吳怡;劉新;;蛋白質(zhì)泛素化、去泛素化與腫瘤發(fā)生的關(guān)系[J];沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2008年01期

4 茅幸;張志剛;吳慧娟;;泛素特異性加工酶2的研究進(jìn)展[J];國際病理科學(xué)與臨床雜志;2012年05期

5 何洪智;趙曉航;張立勇;吳e，

本文編號：384890