目的:神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma,NB）是嬰幼兒及兒童時(shí)期具有高度惡性的第二常見實(shí)體瘤,占兒科惡性腫瘤的6%⁸%。S100A8和S100A9是鈣結(jié)合蛋白S100家族中兩個(gè)重要的成員,二者與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有密切的關(guān)系。但是它們對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的作用及機(jī)制卻少有研究。本文探究了S100A8和S100A9對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移的作用及其生物學(xué)作用機(jī)制。方法:通過生物信息學(xué)分析得到S100A8和S100A9是與神經(jīng)母瘤的發(fā)生發(fā)展有密切相關(guān)性的兩個(gè)蛋白。通過構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白標(biāo)記的重組質(zhì)粒,過表達(dá)組:S100A8-SBI-piggbac、S100A9-SBI-piggbac;低表達(dá)組:shRNA-S100A8（shS100A8或shA8）、shRNA-S100A9（shS100A9或shA9）,將攜帶目的基因的重組質(zhì)粒及其載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中,得到高表達(dá)S100A8、S100A9和低表達(dá)S100A8、S100A9的穩(wěn)定細(xì)胞系;通過平板克隆實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn),檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞的增殖能力,測(cè)定細(xì)胞活力;采用劃痕實(shí)... 

【文章來源】：青島大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：65 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

S100A8過表達(dá)質(zhì)粒圖譜

7圖 1-2 S100A9 過表達(dá)質(zhì)粒圖譜Figure 1-2 S100A9 overexpressed plasmid map0A8 和 shS100A9 低表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建A8 和 shS100A9 目的片段的擴(kuò)增不在 PCR 儀上進(jìn)行。它們是先將A9 的上下游引物溶解稀釋到 100uM。然后用退火緩沖液配制反物+20ul 下游引物+80ulddH2O+40ul 4X annealing buffer， 5min，冷卻過夜。配制濃度為 1%的瓊脂糖凝膠，通過凝膠電后的產(chǎn)物中分離出來。然后用普通瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑回收。同時(shí)，將酶切鑒定后的載體 shRNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)化（DH5α 感進(jìn)質(zhì)粒抽提、定量和酶切。先用 BamH I 在 37℃條件下，酶切

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文用 EcoR I 在 37℃條件下，酶切 1h 后進(jìn)行純化。將酶切鑒定后的 8 和 shS100A9 擴(kuò)增后的產(chǎn)物分別在瓊脂糖凝膠上電泳后，進(jìn)行亮的目的片段和載體在連接體系中的比例。然后連接（16℃、T4DNAhS100A8和shS100A9 與shRNA連接好的體系進(jìn)行轉(zhuǎn)化（Stbl3 感受前準(zhǔn)備好的帶有氨芐霉素（AMP）抗性的 LB 平板上，檢查 LB 平出（倒置）。確認(rèn)后，將 LB 平板置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行過夜培養(yǎng)。挑選一些進(jìn)行菌落 PCR。把菌落 PCR 呈現(xiàn)陽(yáng)性的 shS100A8 和 s挑取單克隆后，在加入 AMP 抗生素的 LB 培養(yǎng)基中進(jìn)行搖菌。然無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒）、定量，最后用 XhoI 進(jìn)行酶切鑒果呈陽(yáng)性的質(zhì)粒與合適的引物一起送測(cè)序，質(zhì)粒測(cè)序委托于北京有限公司。所得到的質(zhì)粒 shS100A8 見圖 1-3，shS100A9 見圖 1-


本文編號(hào)：3578293