背景與目的:神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤,且預(yù)后極差。傳統(tǒng)治療手段如手術(shù)、化療、放療等效果難以使人滿意。非編碼小分子RNA（miRNA）是一類內(nèi)生的、參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的RNA,其對細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及個(gè)體發(fā)育等均有一定的調(diào)控作用,同時(shí)其還與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展存在緊密的關(guān)聯(lián)。另外,人體內(nèi)部分信號通路的異常表達(dá)也與膠質(zhì)瘤密切相關(guān)。據(jù)相關(guān)研究顯示,miRNA所調(diào)控的Wnt信號通路有望成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷的潛在靶點(diǎn)。但是,miRNA調(diào)控Wnt信號通路具體機(jī)制尚未完全明確。本研究擬對miR-129-5p在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中通過調(diào)控Wnt信號通路發(fā)揮的作用及相關(guān)機(jī)制做進(jìn)一步探討。方法:通過實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）分析人膠質(zhì)瘤樣本中miR-129-5p的表達(dá)水平。運(yùn)用CCK8細(xì)胞毒性活性檢測法（CCK-8）、流式細(xì)胞術(shù)、Ed U細(xì)胞增殖檢測法、血管生成檢測、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、體外3D遷移和干細(xì)胞球形成實(shí)驗(yàn)來評估m(xù)iR-129-5p在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）中的作用。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和RNA-Ch IP（染色質(zhì)免疫沉淀）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Wnt5a是否是mi... 

【文章來源】：南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：91 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

神經(jīng)膠質(zhì)瘤中miR-129-5p的表達(dá)下調(diào)

33圖2. miR-129-5p直接靶向作用于Wnt5A. 維恩圖顯示miR-129-5p通過五種不同的預(yù)測算法TargetScan，miRDB，PITA，miRanda和miRWalk直接作用于靶目標(biāo)Wnt5a。 B. 對Wnt5a-3'UTR中miR-129-5p靶序列的預(yù)測顯示，構(gòu)建突變的Wnt5a-3'UTR靶序列。 C. 用Wnt5a-3'UTR-WT或Wnt5a-3'UTR-MUT報(bào)告基因以及40nM或80nM miR-129-5p或miR-NC模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的熒光素酶測定（每組分別做三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次重復(fù)六遍）。D. 使用過量表達(dá)miR-NC或miR-129-5p的N3或U251細(xì)胞中的Pan-Ago2抗體對Ago2 /RISC（RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物）進(jìn)行免疫沉淀（左）。 IgG作陰性對照，β-actin用作組內(nèi)對照。RT-qPCR分析顯示，與對照組相比，過表達(dá)miR-129-5p的N3或U251細(xì)胞中摻入RISC的miR-129-5p量明顯升高。 U6 RNA用作內(nèi)部對照，對

圖3. miR-129-5p通過靶向Wnt5a來抑制GBM的細(xì)胞增殖和血管生成A. 用Wnt5a質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染N3/miR-129-5p，K3/miR-129-5p和U251/miR-129-5p細(xì)胞，蛋白質(zhì)免疫印跡法對Wnt5a轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析（每組分別做三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次重復(fù)六遍）， GAPDH作為內(nèi)參對照。 B.未經(jīng)轉(zhuǎn)染或用pcDNA3.1-Wnt5a質(zhì)粒（Wnt5a）轉(zhuǎn)染的miR-NC-或miR-129-5p-轉(zhuǎn)染的N3或U251細(xì)胞的集落形成能力（每組分別做三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次重復(fù)六遍）。比例尺為2.5毫米。C.miR-129-5p的過表達(dá)抑制細(xì)胞增殖，而在有外源性Wnt5a作用時(shí)，miR-129-5p的過表達(dá)對N3和U251細(xì)胞增殖的抑制作用得以恢復(fù)（每組分別做三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次重復(fù)六遍）。 D. 對miR-NC，miR-129-5p或miR-129-5p加Wnt5a轉(zhuǎn)染的N3和U251細(xì)胞進(jìn)行EdU增殖分析檢測（每組6個(gè)重復(fù)，每組分別做3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）。比例尺為100μm。 E. 用miR-NC，miR-129-5p或miR-129-5p加Wnt5a轉(zhuǎn)染N3和U251 GBM細(xì)胞后3天，對細(xì)胞周期進(jìn)行測定（每組分別做三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次重復(fù)六遍）。F. miR-NC，miR-129-5p或miR-129-5p模擬物加Wnt5a轉(zhuǎn)染N3或U251


本文編號：3543737