本文關(guān)鍵詞：基于干細(xì)胞的新型靶向復(fù)合生物基因載體的構(gòu)建與其對(duì)缺血性腦卒中的治療研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：以靶向藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體系(TDDS)的理念,將特異性針對(duì)腦部病變組織的靶向肽通過適當(dāng)?shù)男揎検蛊溆行нB接到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)表面,介導(dǎo)干細(xì)胞的主動(dòng)靶向,同時(shí)采用非病毒載體高效安全地導(dǎo)入治療基因,構(gòu)建全新的能趨向腦部疾病、攜載基因而自身又具有神經(jīng)生長治療作用的復(fù)合功能生物載體,并結(jié)合安全性評(píng)價(jià)等,全面評(píng)估MSCs作為腦靶向生物載體的可行性及其針對(duì)缺血性腦卒中的治療前景。方法：1、合成N端修飾棕櫚酸的腦靶向肽段CLEVSRKNC,以棕櫚酸為錨點(diǎn)修飾到細(xì)胞膜表面,并篩選出最佳的修飾條件；2、利用流式細(xì)胞技術(shù)及熒光顯微成像技術(shù)對(duì)靶向肽修飾的干細(xì)胞(Pep-MSCs)進(jìn)行表征,MTT法考察靶向肽細(xì)胞毒性,進(jìn)一步考察靶向肽修飾對(duì)MSCs神經(jīng)分化潛能的影響,明確靶向肽的修飾效率和生物安全性；3、建立體外神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation, OGD)模型,考察Pep-MSCs的體外遷移,同時(shí)考察Pep-MSCs對(duì)受損神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用；4、建立大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型,利用小動(dòng)物活體成像技術(shù)和組織切片技術(shù),考察Pep-MSCs對(duì)于腦部缺血病灶的靶向作用,以及Pep-MSCs在MCAO模型大鼠體內(nèi)的分布；5、利用已經(jīng)建立的非病毒載體轉(zhuǎn)染體系,采用自主合成的非病毒基因載體精胺-普魯蘭糖(spermine-pullulan, SP)對(duì)MSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染,考察轉(zhuǎn)染效率；6、結(jié)合miR-133b的轉(zhuǎn)染和靶向肽修飾,在MCAO大鼠尾靜脈移植攜載miR-133b的Pep-MSCs (Pep-133b-MSCs)后,通過神經(jīng)功能評(píng)分(mNSS)和組織切片觀察,評(píng)價(jià)niR-pep-MSCs的治療效果。結(jié)果：成功構(gòu)建復(fù)合功能細(xì)胞基因載體Pep-MSCs,流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定靶向肽有較高的修飾效率,激光共聚焦顯微鏡觀察表明靶向肽成功地修飾到了細(xì)胞膜表面,MTT檢測(cè)和MSCs神經(jīng)分化功能評(píng)價(jià)均表明此修飾方法安全有效。在體外OGD模型中,與未經(jīng)修飾的MSCs相比,Pep-MSCs顯示出更高的遷移活性,同時(shí)靶向肽的修飾并未影響MSCs對(duì)于受損神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。將構(gòu)建的Pep-MSCs尾靜脈移植到MCAO大鼠體內(nèi)后,小動(dòng)物活體成像以及組織切片結(jié)果顯示,靶向肽能介導(dǎo)MSCs到達(dá)缺血病灶,增強(qiáng)MSCs的歸巢性,同時(shí)減少M(fèi)SCs在非病灶組織的分布。另一方面,利用已經(jīng)建立的非病毒轉(zhuǎn)染體系對(duì)MSCs進(jìn)行基因改造,非病毒載體SP能高效安全地轉(zhuǎn)染miR-133b,并且轉(zhuǎn)染miR-133b后的MSCs對(duì)受損神經(jīng)細(xì)胞顯示更好的保護(hù)作用。進(jìn)一步地,結(jié)合基因轉(zhuǎn)染和靶向肽修飾,攜載miR-133b的Pep-MSCs在尾靜脈移植到MCAO大鼠體內(nèi)后顯示了較好的治療效果,mNSS評(píng)分顯示miR-pep-MSCs有更好的神經(jīng)保護(hù)的作用,組織切片結(jié)果表明基因轉(zhuǎn)染和靶向肽修飾都未影響MSCs的神經(jīng)分化功能。結(jié)論：成功構(gòu)建Pep-MSCs,其對(duì)缺血性腦卒中病灶組織有很強(qiáng)的靶向性,作為復(fù)合功能基因靶向載體,其能攜載治療基因miR-133b到達(dá)病灶組織,又能發(fā)揮MSCs自身的治療作用,在缺血性腦卒中的治療中顯示了很好的應(yīng)用潛力。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 靶向肽 腦靶向 缺血性腦卒中 干細(xì)胞療法 非病毒轉(zhuǎn)染
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R743.3
【目錄】：

• 致謝5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 全文縮寫表13-19
• 引言19-24
• 第一章 靶向肽-骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建24-37
• 1.1 儀器與試劑25-26
• 1.1.1 儀器25
• 1.1.2 試劑25-26
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物26
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法26-29
• 1.2.1 原代MSCs的制備和培養(yǎng)26-27
• 1.2.2 棕櫚酸(Palmitic acid,PA)-多肽-MSCs的修飾27
• 1.2.3 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)檢測(cè)27-28
• 1.2.4 大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型的建立28
• 1.2.5 腦提取液的制備28-29
• 1.2.6 MSCs神經(jīng)分化29
• 1.2.7 數(shù)據(jù)分析29
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論29-35
• 1.3.1 PA-peptide修飾條件的篩選29-32
• 1.3.2 PA-peptide修飾MSCs的表征32-33
• 1.3.3 PA-peptide修飾對(duì)MSCs生物活性的影響33-35
• 1.4 本章小結(jié)35-37
• 第二章 靶向肽修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的靶向性考察37-53
• 2.1 儀器與試劑37-39
• 2.1.1 儀器37-38
• 2.1.2 試劑38
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物38-39
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法39-41
• 2.2.1 原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte)39
• 2.2.2 Pep-MSCs體外遷移能力的考察39-40
• 2.2.3 MCAO模型的建立及鑒定40
• 2.2.4 Pep-MSCs的體內(nèi)靶向性考察40-41
• 2.2.5 數(shù)據(jù)分析41
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論41-52
• 2.3.1 Pep-MSCs的體外趨向性考察41-46
• 2.3.2 Pep-MSCs的體內(nèi)靶向性考察46-52
• 2.4 本章小結(jié)52-53
• 第三章 攜載治療基因的復(fù)合功能腦靶向載體對(duì)缺血性腦卒中治療效果的評(píng)價(jià)53-69
• 3.1 儀器與試劑53-55
• 3.1.1 儀器53-54
• 3.1.2 試劑54
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物54-55
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法55-58
• 3.2.1 SP/RNA復(fù)合物的制備55
• 3.2.2 轉(zhuǎn)染效率的評(píng)價(jià)和細(xì)胞毒性測(cè)試55
• 3.2.3 攜載miR-133b的MSCs對(duì)于受損星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用55-56
• 3.2.4 干細(xì)胞移植和行為學(xué)測(cè)試56-57
• 3.2.5 組織學(xué)分析57
• 3.2.6 MSCs體內(nèi)神經(jīng)分化能力評(píng)價(jià)57
• 3.2.7 數(shù)據(jù)分析57-58
• 3.3 結(jié)果與討論58-67
• 3.3.1 miR-133b的轉(zhuǎn)染58-62
• 3.3.2 轉(zhuǎn)染miR-133b的MSCs對(duì)受損星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用62-63
• 3.3.3 缺血性腦卒中的體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)63-67
• 3.4 本章小結(jié)67-69
• 全文總結(jié)69-72
• 參考文獻(xiàn)72-81
• 綜述81-137
• References116-137
• 作者簡歷137-139

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張貴斌;邱張;徐運(yùn)蘭;王偉;謝敏杰;;選擇性CDK抑制劑對(duì)大鼠局灶性腦缺血后膠質(zhì)增殖及疤痕形成的抑制作用[J];神經(jīng)損傷與功能重建;2006年03期

  本文關(guān)鍵詞：基于干細(xì)胞的新型靶向復(fù)合生物基因載體的構(gòu)建與其對(duì)缺血性腦卒中的治療研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：339231