目的本文旨在探討一種新型Wnt替代蛋白（Wnt surrogate,Wnt-S）對大腦中多種細胞Wnt/β-catenin信號通路的作用,以及可能治療腦卒中的一種新的策略。方法合成Wnt-S片段,利用分子克隆的方法將此片段與載體pcDNA3.1（+）連接,再與大腸桿菌作轉化,鋪平板,挑單克隆,搖菌提取質粒,用PEI轉染法將質粒與HEK 293F細胞進行瞬時轉染,取上清然后純化Wnt-S蛋白,蛋白免疫印跡（Western blot）檢測含6x His標簽的Wnt-S蛋白,并在HEK 293細胞中進行活性驗證。培養(yǎng)HEK 293,hCMEC/D3,HBVP,HA,HOC,NSC,BV2,Neuron,采用免疫熒光染色的方法分別檢測這些細胞特異的標志物,實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR）分別檢測這些細胞中受體FZD1-10（Frizzled家族）、LRP5/6以及相應標志物的表達情況。用Wnt-S蛋白分別處理這些細胞,實時熒光定量PCR檢測Wnt/β-catenin信號通路靶基因Axin2的表達情況。小鼠腦定位SGZ區(qū)注入Wnt-S腺病毒,檢測神經干細... 

【文章來源】：錦州醫(yī)科大學遼寧省

【文章頁數】：54 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

（A/B）Wnt-SinpUC57-Kan和Wnt-SinpcDNA3.1(+)雙酶切核酸電泳圖

說明轉染后第 5 天應當停止培養(yǎng) 293 F 細胞（此時細胞活度不應低于 70%），收集上清（圖2A）。依次用 20-160mM 咪唑洗脫鎳柱填料中的 Wnt-S 蛋白，根據 GE Healthcare公司說明書的建議（該填料有高特異性的 His 標簽蛋白吸附能力，40mM 咪唑即可洗脫較高純度的目的蛋白），結合我們的 Western blot 實驗結果，我們選擇60mM 咪唑洗脫后的蛋白溶液，得到純度更高的 Wnt-S 蛋白（圖 2B）。即 Wnt-S表達純化的最佳條件為轉染后第 5 天收集上清，60mM 咪唑洗脫鎳柱，并濃縮蛋白溶液。

圖 I: Neuron，神經元細胞標志物 MAP-2 高表達圖 3（A-I） 免疫熒光染色四、FZD1-10,LRP5/6 和相應 Marker 的表達水平人胚胎腎細胞 293 中 FZD3,6,7 高表達，FZD1,2,4,5 和 Lrp6 表達較


本文編號：3383314