發(fā)布時(shí)間：2021-09-04 13:02

　　目的本文旨在探討一種新型Wnt替代蛋白（Wnt surrogate,Wnt-S）對(duì)大腦中多種細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用,以及可能治療腦卒中的一種新的策略。方法合成Wnt-S片段,利用分子克隆的方法將此片段與載體pcDNA3.1（+）連接,再與大腸桿菌作轉(zhuǎn)化,鋪平板,挑單克隆,搖菌提取質(zhì)粒,用PEI轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒與HEK 293F細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,取上清然后純化Wnt-S蛋白,蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)含6x His標(biāo)簽的Wnt-S蛋白,并在HEK 293細(xì)胞中進(jìn)行活性驗(yàn)證。培養(yǎng)HEK 293,hCMEC/D3,HBVP,HA,HOC,NSC,BV2,Neuron,采用免疫熒光染色的方法分別檢測(cè)這些細(xì)胞特異的標(biāo)志物,實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR）分別檢測(cè)這些細(xì)胞中受體FZD1-10（Frizzled家族）、LRP5/6以及相應(yīng)標(biāo)志物的表達(dá)情況。用Wnt-S蛋白分別處理這些細(xì)胞,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路靶基因Axin2的表達(dá)情況。小鼠腦定位SGZ區(qū)注入Wnt-S腺病毒,檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)... 

【文章來(lái)源】：錦州醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁(yè)數(shù)】：54 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

（A/B）Wnt-SinpUC57-Kan和Wnt-SinpcDNA3.1(+)雙酶切核酸電泳圖

說(shuō)明轉(zhuǎn)染后第 5 天應(yīng)當(dāng)停止培養(yǎng) 293 F 細(xì)胞（此時(shí)細(xì)胞活度不應(yīng)低于 70%），收集上清（圖2A）。依次用 20-160mM 咪唑洗脫鎳柱填料中的 Wnt-S 蛋白，根據(jù) GE Healthcare公司說(shuō)明書(shū)的建議（該填料有高特異性的 His 標(biāo)簽蛋白吸附能力，40mM 咪唑即可洗脫較高純度的目的蛋白），結(jié)合我們的 Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇60mM 咪唑洗脫后的蛋白溶液，得到純度更高的 Wnt-S 蛋白（圖 2B）。即 Wnt-S表達(dá)純化的最佳條件為轉(zhuǎn)染后第 5 天收集上清，60mM 咪唑洗脫鎳柱，并濃縮蛋白溶液。

圖 I: Neuron，神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物 MAP-2 高表達(dá)圖 3（A-I） 免疫熒光染色四、FZD1-10,LRP5/6 和相應(yīng) Marker 的表達(dá)水平人胚胎腎細(xì)胞 293 中 FZD3,6,7 高表達(dá)，F(xiàn)ZD1,2,4,5 和 Lrp6 表達(dá)較


本文編號(hào)：3383314