目的探討抑制脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase,SYK）對(duì)缺氧/缺糖損傷誘導(dǎo)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制。方法分離培養(yǎng)10只SD懷孕大鼠（190²30 g,胎齡16 d）胎鼠的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞并用MAP2免疫熒光法進(jìn)行鑒定。建立缺氧/缺糖損傷的體外模型,caspase-3熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)caspase-3活性,Annexin-V FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡,q RT-PCR檢測(cè)SYK和凋亡相關(guān)的原癌基因Fra-1 m RNA的表達(dá),Western Blot檢測(cè)SYK、Bcl-2和Fra-1蛋白的表達(dá)。Control組:無(wú)轉(zhuǎn)染處理的缺氧/缺糖損傷的神經(jīng)元;SYK siRNA組:轉(zhuǎn)染SYK siRNA的缺氧/缺糖損傷的神經(jīng)元;SYK-Fra-1 siRNA組:同時(shí)轉(zhuǎn)染SYK siRNA和Fra-1 siRNA的缺氧/缺糖損傷的神經(jīng)元;non-specific siRNA組:轉(zhuǎn)染non-specific siRNA的氧/缺糖損傷的神經(jīng)元。結(jié)果 MAP2免疫熒光鑒定為神經(jīng)元細(xì)胞。缺氧/缺糖損傷誘導(dǎo)神經(jīng)元SYK表達(dá)（P<0.01... 

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缺氧/缺糖損傷皮質(zhì)神經(jīng)元中SYK的蛋白電泳圖

:正常細(xì)胞組;2:anoxia/hypoglycemia組圖1缺氧/缺糖損傷皮質(zhì)神經(jīng)元中SYK的蛋白電泳圖2．3抑制細(xì)胞中SYK的表達(dá)利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)抑制經(jīng)缺氧/缺糖處理的神經(jīng)元細(xì)胞的SYK表達(dá)量，為了檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率，我們檢測(cè)了SYKmRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，SYKsiRNA組mRNA表達(dá)量(1．27±0．34)相對(duì)無(wú)轉(zhuǎn)染處理組(2.82±0．27)和轉(zhuǎn)染non-specificsiRNA的細(xì)胞組(2.95±0．79)明顯下調(diào)(P＜0．05)，SYKsiRNA組SYK蛋白表達(dá)量(1．27±0．34)相對(duì)無(wú)轉(zhuǎn)染處理組(2.54±0．56)和轉(zhuǎn)染non-specificsiRNA的細(xì)胞組(2.83±0．71)明顯下調(diào)(P＜0．05)(圖2)。1:無(wú)轉(zhuǎn)染處理;2:轉(zhuǎn)染SYKsiRNA的細(xì)胞;3:轉(zhuǎn)染non-spe-cificsiRNA的細(xì)胞圖2轉(zhuǎn)染后神經(jīng)元中SYK的蛋白電泳圖2．4抑制SYK表達(dá)降低缺氧/缺糖損傷誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡為了檢測(cè)抑制SYK對(duì)缺氧/缺糖損傷誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響，我們采用了caspase-3活性檢測(cè)和Annexin-VFITC/PI方法測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，SYKsiRNA組中caspase-3活性(0．16±0．04)較無(wú)轉(zhuǎn)染處理組(0．42±0．02)和轉(zhuǎn)染non-specificsiRNA的細(xì)胞組(0．46±0．11)顯著降低(P＜0．01)。SYKsiRNA組細(xì)胞凋亡率(20．00±5．57)%較無(wú)轉(zhuǎn)染處理組(51．00±3．90)%和轉(zhuǎn)染non-specificsiRNA的細(xì)胞組(57．70±8．08)%顯著降低(P＜0．05)(圖3)。http://aammt．tmmu．edu．cn第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，39(13)1383

1:Control;2:SYKsiRNA組;3:non-specificsiRNA圖3細(xì)胞流式檢測(cè)抑制SYK對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響2．5抑制SYK表達(dá)使Fra-1表達(dá)量上調(diào)為了探究抑制SYK對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧/缺糖損傷起保護(hù)作用的可能機(jī)制，我們檢測(cè)了SYK受到抑制后經(jīng)缺氧/缺糖處理的神經(jīng)元細(xì)胞中Fra-1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組(0．93±0．11)和non-specificsiRNA組(1．18±0．41)相比，SYKsiRNA組(2．79±0．37)中Fra-1mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)(P＜0．01);與對(duì)照組(1．03±0．05)和non-specificsiRNA組(1．27±0．49)相比，SYKsiRNA組(2．49±0．42)Fra-1蛋白表達(dá)量也明顯上調(diào)(P＜0．05)(圖4)。1:Control;2:SYKsiRNA組;3:non-specificsiRNA組圖4WesternBlot檢測(cè)抑制SYK對(duì)Fra-1表達(dá)量的影響2．6同時(shí)抑制SYK和Fra-1促進(jìn)缺氧/缺糖對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的損傷為了進(jìn)一步探究可能的機(jī)制，我們利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)同時(shí)抑制SYK和Fra-1的表達(dá)量，為了檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，我們檢測(cè)了SYK和Fra-1的蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，SYK-Fra-1-siRNA組中SYK和Fra-1的蛋白表達(dá)量較non-specificsiRNA組中均顯著下降(圖5)。然后，我們將兩者表達(dá)量同時(shí)收到抑制的細(xì)胞進(jìn)行缺氧/缺糖處理，檢測(cè)caspase-3活性和Bcl-2蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示SYK-Fra-1-siRNA組中caspase-3活性(0.530±0.045)相對(duì)于SYKsiRNA組(0．240±0．085)顯著上升(P＜0．01)，與non-specificsiRNA組(0．590±0.003)接近。SYK-Fra-1-siRNA組中Bcl-2蛋白表達(dá)量(1．31±0．25)相對(duì)于SYKsiRNA組(4．47±0．43)顯著下降(P＜0．01)，與non-specificsiRNA組(1．68±0．07)接近(圖6)。1:non-specificsiRNA組;2:SYKsiRNA組;3:SYK-Fra-1-siRNA組A:同時(shí)抑制SYK和Fra-1后兩者的蛋白電泳圖;B:同時(shí)抑制SYK和Fra-1后兩者的蛋白變化量(n=3，x珋±s);SYK-Fra-1-s


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