本文關鍵詞：番茄紅素對轉染SOD1-G93A的PC12細胞線粒體的保護作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種運動神經系統(tǒng)的退行性疾病,上、下運動神經元均受累,臨床上主要表現(xiàn)為肌肉逐漸萎縮與無力,最后在3-5年內因呼吸衰竭而死亡。5-10%的ALS是家族性ALS(f ALS),90%ALS是散發(fā)性ALS(s ALS)。關于ALS的發(fā)病機制,目前尚未完全清楚,可能與超氧化物歧化酶1(SOD1)基因突變、氧化應激、免疫學機制、線粒體功能障礙、神經元周圍膠質細胞的異常、氧化毒性等有關,而突變的SOD1基因被認為是引起f ALS最常見的基因,現(xiàn)已報道了多個SOD1突變位點,其中以G93A突變位點最多,而向小鼠體內轉入人突變的SODl-G93A后,小鼠模型也因與人有類似的臨床發(fā)病特點而成為世界上公認的研究ALS的動物模型。隨著大量研究的進展,人們發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙在ALS發(fā)生發(fā)展過程中起著非常關鍵的作用,線粒體功能障礙有可能是ALS發(fā)病的始動因素,而與ALS發(fā)病密切相關的SOD1就在線粒體上定位存在。更有研究發(fā)現(xiàn),在ALS患者以及動物模型的運動神經元細胞中的確存在著大量形態(tài)異常的線粒體和突變蛋白的蓄積。SOD1的主要功能是通過歧化反應將線粒體內的有毒物質(如ROS)氧化,從而達到解毒的目的。而SOD1基因發(fā)生基因突變時,SOD1與鋅的結合力下降,從而導致了對運動神經元的毒性,而引起患者出現(xiàn)線粒體空泡化和膨脹。并且,SOD1突變的蛋白凝集物會阻礙線粒體的運輸通道,抑制線粒體的生物學功能,從而造成線粒體損傷,同時激活細胞凋亡因子,造成運動神經元死亡而發(fā)生ALS。動力相關蛋白(dynamin related protein1,Drp1)與線粒體動態(tài)變化有密切聯(lián)系,是介導線粒體分裂的因子,在正常狀態(tài)下,細胞內的Drp1大部分位于細胞質基質中,大約只有3%結合在線粒體的外膜上。哺乳動物的線粒體進行分裂時,線粒體分裂蛋白1(Fis1)會促進Drp1聚集到線粒體的外膜上,以促使線粒體發(fā)生分裂,故Drp1表達增強可致線粒體持續(xù)分裂而引起細胞凋亡。PC12細胞為大鼠嗜鉻細胞瘤細胞,該細胞富含合成及分解多巴胺所必須的酪氨酸羥化酶,單胺氧化酶等,其化學特性十分接近中腦多巴胺能神經元,同時具備瘤細胞特性,因此廣泛用于中樞神經系統(tǒng)變性疾病的研究。番茄紅素(lycopene)是一種類胡蘿卜素,是存在于植物中的一種天然色素,主要存在于番茄、胡蘿卜、西瓜和番石榴中,其中番茄的含量最高,目前它是自然界的植物中發(fā)現(xiàn)的最強抗氧化劑之一,具有很強的抗氧化作用和清除自由基的能力,具有預防心臟病、保護心血管、減緩動脈粥樣硬化、預防多種癌癥、抗老化、保護皮膚等多種生理功能。其在阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)等神經變性疾病中的保護作用已得到證實,但在ALS方面卻未有報道。目的:本實驗采用SOD1-G93A轉染的PC12細胞制備ALS細胞模型,探討番茄紅素對轉染所致的PC12細胞線粒體損傷的保護作用。方法:采用空(Empty,E)質粒、野生型(Wild Type,WT)質粒、SOD1-G93A質粒轉染PC12細胞,顯微鏡下觀察轉染效率,選擇轉染效率達70%及以上的細胞孔,CCK-8檢測細胞活力,并驗證轉染質粒后導致的細胞損傷。給予正常培養(yǎng)的細胞不同濃度的番茄紅素(0、1、10、20、50、100μmol?L)處理,CCK-8檢測細胞活力,觀察藥物對細胞的作用。使用SOD1-G93A質粒轉染的PC12細胞,選擇達轉染效率的細胞孔,分別給予不同低濃度的番茄紅素(0、0.1、0.5、1、5、10、20μmol?L)處理,CCK-8檢測細胞活力,篩選番茄紅素的最適藥物濃度。將細胞分為正常細胞組,轉染E質粒組(E),轉染WT質粒組(WT),轉染SOD1-G93A組(SOD1-G93A)。各組均分為空白對照組、番茄紅素組,每組3個孔。番茄紅素組使用含最適藥物濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞,對照組給予普通培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后,mitotraker染色流式細胞儀檢測ROS水平,激光共聚焦顯微鏡觀察Drp1的變化,以觀察番茄紅素對SOD1-G93A轉染的PC12細胞所致線粒體損傷的保護作用。結果:1轉染E、WT、SOD1-G93A質粒后,顯微鏡下觀察,選擇轉染效率達70%及以上的細胞孔,CCK-8檢測細胞活力,E、WT、SOD1-G93A組與對照組比較,細胞活力逐漸下降,SOD1-G93A組細胞活力下降最明顯,差異均有統(tǒng)計學意義(P㩳0.05)。E組與WT組比較,差異無統(tǒng)計學意義,SOD1-G93A組與E、WT組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P㩳0.05),說明造模成功。2 CCK-8檢測結果顯示給予正常細胞不同濃度的番茄紅素后,20μmol?L、50μmol?L、100μmol?L組與對照組比較,細胞活力明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P㩳0.05),說明高濃度的番茄紅素可對細胞生長、存活產生不利影響,不可用于細胞實驗。給予轉染SOD1-G93A的細胞低濃度的番茄紅素后,與對照組比較,細胞活力逐漸升高,至藥物濃度為10μmol?L時,細胞活力達最高,后又下降,因此篩選出可用于實驗的最適藥物濃度為10μmol?L。3轉染WT質粒與轉染E質粒的PC12細胞相比,細胞內ROS水平升高(P㩳0.05),轉染SOD1-G93A的PC12細胞與轉染E質粒、轉染WT質粒的細胞相比,轉染表達G93A的PC12細胞ROS水平明顯升高(P㩳0.05)。轉染SOD1-G93A的PC12細胞與轉染E質粒、WT質粒的細胞相比,Drp1水平明顯升高,說明轉染表達G93A的PC12細胞存在線粒體損傷。4用最適藥物濃度的番茄紅素干預PC12細胞,E、WT、SOD1-G93A各組番茄紅素組與對照組比較,ROS含量均明顯降低(P㩳0.05),Drp1含量減少。結論:1成功制備了ALS的細胞模型,轉染表達SOD1-G93A的PC12細胞存在線粒體損傷。2合適濃度的番茄紅素可提高細胞活力,對G93A-SOD1轉染的PC12細胞有保護作用。3番茄紅素可協(xié)助清除ALS細胞模型內過量堆積的活性氧及降低Drp1的含量,這可能是番茄紅素保護線粒體、減輕細胞損傷的可能機制之一。
【關鍵詞】：肌萎縮側索硬化 番茄紅素 PC12細胞 線粒體 活性氧 動力相關蛋白
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R744.8
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-22
• 結果22-24
• 附圖24-28
• 附表28-30
• 討論30-32
• 結論32
• 參考文獻32-35
• 綜述 番茄紅素的研究進展35-46
• 參考文獻41-46
• 致謝46-47
• 個人簡歷47

【參考文獻】

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1 屈明s，

本文編號：331600