發(fā)布時(shí)間：2021-07-20 05:36

　　目的建立體外穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白（RFP）的人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。方法用帶有紅色熒光蛋白基因的慢病毒轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察RFP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況。流式細(xì)胞儀分選紅色熒光表達(dá)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，完成克隆篩選后的人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)20代，再次經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定其轉(zhuǎn)染率；MTT法比較轉(zhuǎn)染前后干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線變化；通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)紅色熒光（RFP）基因整合到干細(xì)胞基因組。然后對(duì)轉(zhuǎn)染后的干細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性分析：細(xì)胞免疫組化鑒定轉(zhuǎn)染后干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133、Nestin的表達(dá)情況；由于腫瘤干細(xì)胞具有多向分化潛能，故在含胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)10天誘導(dǎo)其向膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞分化，細(xì)胞免疫組化分析分化后GFAP,S100（膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞標(biāo)志物）表達(dá)；在血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基培養(yǎng)10天誘導(dǎo)其向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，并在Matrigel膠中3D培養(yǎng)，在顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞立體形態(tài)，細(xì)胞免疫組化分析內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物CD31表達(dá)；收集紅色熒光蛋白表達(dá)干細(xì)胞移植到綠色熒光裸鼠皮下，成瘤后取出腫瘤，行超薄冰凍切片、HE染色，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后干細(xì)胞在綠色熒光裸鼠體內(nèi)生... 

【文章來(lái)源】：蘇州大學(xué)江蘇省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：54 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

SU2培養(yǎng)第七天倒置顯微鏡下見細(xì)胞呈球狀懸浮生長(zhǎng),部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)

2.2 .慢病毒未轉(zhuǎn)染前干細(xì)胞球的鑒定SU2形成干細(xì)胞球后，行CD133,Nestin細(xì)胞免疫熒光染色，結(jié)果顯示克隆球中大部分細(xì)胞膜胞漿發(fā)出紅色熒光（表明其表達(dá)CD133,見圖2A）或者綠色熒光（表明其表達(dá)Nestin,見圖2B）;而內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31及KDR的免疫熒光染色均呈陰性（圖片未給出）。圖2 腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞呈干細(xì)胞球樣生長(zhǎng):(A) 腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞免疫熒光染色CD133呈陽(yáng)性（×100倍）； (B) Nestin免疫熒光染色陽(yáng)性，其中可見干細(xì)胞球（×100倍）2.3. 紅色熒光慢病毒轉(zhuǎn)染SU2,體外連續(xù)培養(yǎng)20代后在熒光顯微鏡下觀察，RFP仍呈高表達(dá)見圖2。圖2. 轉(zhuǎn)染RFP人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(RFP-SU2)呈懸浮球狀生長(zhǎng)，熒光顯微鏡可見細(xì)胞發(fā)紅色熒光（A×200 B×100）2.4．流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)結(jié)果慢病毒轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（SU2）后，經(jīng)FACS篩選RFP陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，在體外連續(xù)培養(yǎng)20代，再次經(jīng)FCM檢測(cè)其轉(zhuǎn)染率達(dá)75%以上（見圖3B），考慮到部分細(xì)胞紅色AB

2.3. 紅色熒光慢病毒轉(zhuǎn)染SU2,體外連續(xù)培養(yǎng)20代后在熒光顯微鏡下觀察，RFP仍呈高表達(dá)見圖2。圖2. 轉(zhuǎn)染RFP人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(RFP-SU2)呈懸浮球狀生長(zhǎng)，熒光顯微鏡可見細(xì)胞發(fā)紅色熒光（A×200 B×100）2.4．流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)結(jié)果慢病毒轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（SU2）后，經(jīng)FACS篩選RFP陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，在體外連續(xù)培養(yǎng)20代，再次經(jīng)FCM檢測(cè)其轉(zhuǎn)染率達(dá)75%以上（見圖3B），考慮到部分細(xì)胞紅色AB

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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