本文關(guān)鍵詞：過表達(dá)Nurr1基因的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：探討Nurr1基因?qū)π∧z質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)的影響及過表達(dá)Nurr1基因的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的影響,并初步探討其可能相關(guān)的作用機(jī)制,為帕金森病的神經(jīng)干細(xì)胞移植治療提供新的思路和方法,使治療效果得到改善。方法：1.解剖分離新生(0～2d)SD大鼠大腦皮質(zhì),經(jīng)胰酶消化及機(jī)械吹打制成單細(xì)胞懸液,接種于含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng),7-10 d后,經(jīng)機(jī)械振搖和差速貼壁法,純化小膠質(zhì)細(xì)胞,并進(jìn)行CD11b/c免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。2.將全基因合成的大鼠Nurr1基因編碼序列克隆至真核表達(dá)載體pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV構(gòu)建重組質(zhì)粒pCDH-Nurr1,并進(jìn)行酶切鑒定及序列分析。再以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)重組質(zhì)粒pCDH-Nurr1轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細(xì)胞。3.向過表達(dá)Nurr1基因的小膠質(zhì)細(xì)胞和單純小膠質(zhì)細(xì)胞中加入LPS以激活,并設(shè)陰性對(duì)照組,相同時(shí)間點(diǎn)收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液,用ELISA法檢測(cè)不同狀態(tài)下小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥相關(guān)因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子的差異以Nurr1基因?qū)Σ煌瑺顟B(tài)下小膠質(zhì)細(xì)胞分泌上述各種因子的影響。4.解剖分離孕14d的SD大鼠胚胎腹側(cè)中腦組織,經(jīng)機(jī)械吹打制成單細(xì)胞懸液,接種于NSCs完全培養(yǎng)基中,觀察其生長、分化并進(jìn)行Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定以及誘導(dǎo)分化后(接種于NSCs分化培養(yǎng)基中)的β-3-tubulin、GFAP、TH免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。5.采用Transwell系統(tǒng),下層培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞,上層培養(yǎng)NSCs,并分組如下：(1)單純小膠質(zhì)細(xì)胞與NSCs共培養(yǎng)；(2)過表達(dá)Nurr1基因的小膠質(zhì)細(xì)胞與NSCs共培養(yǎng)。在共培養(yǎng)3d、6d、9d時(shí),觀察兩組NSCs的存活、生長,以及向DA能神經(jīng)元分化的情況。6.上述時(shí)間點(diǎn)分別采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)兩組NSCs向DA能神經(jīng)元的分化情況；Western Blot檢測(cè)兩組NSCs向DA能神經(jīng)元分化的相關(guān)蛋白(DAT、 TH、FOXA2、Otx2、Pitx3、VMAT2、Lmx1a)表達(dá)水平情況；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)兩組NSCs向DA能神經(jīng)元分化成熟相關(guān)基因(DAT、TH、FOXA2、 Otx2、Pitx3、VMAT2、Lmxla)的表達(dá)情況。結(jié)果：1.混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)至7-10 d時(shí),細(xì)胞呈充分分層生長,經(jīng)機(jī)械振搖和差速貼壁的方法獲得純化小膠質(zhì)細(xì)胞,經(jīng)特異性標(biāo)志物CD11b/c免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定為陽性,純度在95%。2.本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了Nurr1基因真核表達(dá)質(zhì)粒載體pCDH-Nurr1,經(jīng)酶切鑒定和序列分析,判定為陽性克隆。3. ELISA法檢測(cè)結(jié)果示過表達(dá)Nurr1基因的小膠質(zhì)細(xì)胞較單純小膠質(zhì)細(xì)胞能顯著減少LPS所致炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-1的分泌,并可促使BDNF、GDNF和PDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌。4.大鼠胚胎NSCs原代培養(yǎng)7d后,可形成大量呈懸浮生長巢蛋白(Nestin)免疫陽性的神經(jīng)球(neurosphere),經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后細(xì)胞呈β-3-tubulin、GFAP或TH免疫陽性。5.在共培養(yǎng)3d、6d、9d時(shí),兩組NSCs分化后經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè),結(jié)果顯示過表達(dá)Nurr1基因的小膠質(zhì)細(xì)胞與NSCs共培養(yǎng)組較單純小膠質(zhì)細(xì)胞與NSCs共培養(yǎng)組可使更多的NSCs向DA能神經(jīng)元分化。6.上述時(shí)間點(diǎn),Western blot結(jié)果顯示過表達(dá)Nurr1基因的小膠質(zhì)細(xì)胞與NSCs共培養(yǎng)組的NSCs向DA能神經(jīng)元分化相關(guān)蛋白(DAT、TH、FOXA2、Otx2、 Pitx3、VMAT2、Lmx1a)的相對(duì)表達(dá)量在多數(shù)時(shí)間點(diǎn)時(shí)較單純小膠質(zhì)細(xì)胞與NSCs共培養(yǎng)組增多。7.上述時(shí)間點(diǎn),實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果顯示,過表達(dá) Nurr1基因的小膠質(zhì)細(xì)胞與NSCs共培養(yǎng)組的NSCs向DA能神經(jīng)元分化成熟相關(guān)基因(DAT、TH、FOXA2、 Otx2、Pitx3、VMAT2、Lmx1a)的表達(dá)情況優(yōu)于單純小膠質(zhì)細(xì)胞與NSCs共培養(yǎng)組。結(jié)論：Nurr1基因不僅可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和炎癥相關(guān)因子的產(chǎn)生,而且可促進(jìn)GDNF、BDNF、DNF等與DA能神經(jīng)元存活和成熟等相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌。過表達(dá)Nurr1基因的小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化為DA能神經(jīng)元具有促進(jìn)作用。Nurr1基因有望成為細(xì)胞移植治療PD的重要、潛在調(diào)控靶點(diǎn)之一
【關(guān)鍵詞】：Nurr1基因 過表達(dá) 小膠質(zhì)細(xì)胞 神經(jīng)干細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R742.5
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 符號(hào)說明11-13
• 引言13-16
• 材料與試劑16-22
• 第一部分 Nurr1基因?qū)π∧z質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)的影響22-36
• 一 材料和方法22-29
• 二 結(jié)果29-34
• 三 討論34-36
• 第二部分 過表達(dá)Nurr1基因的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的影響36-62
• 一 材料和方法36-42
• 二 結(jié)果42-58
• 三 討論58-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-68
• 綜述68-77
• 參考文獻(xiàn)74-77
• 論文發(fā)表情況77-78
• 致謝78

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5 劉鋒,朱長庚;小膠質(zhì)細(xì)胞激活的分子機(jī)制[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;2003年02期

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7 熊懷林,范光碧,胡興宇;小膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血中的作用[J];四川解剖學(xué)雜志;2005年02期

8 魏桂榮,張敏,董繼華,梅元武,劉仁剛;構(gòu)建一種高產(chǎn)量小膠質(zhì)細(xì)胞體外純化培養(yǎng)的方法(英文)[J];中國臨床康復(fù);2005年21期

9 趙洋;孫素真;;小膠質(zhì)細(xì)胞和癲癇[J];中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志;2008年01期

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本文編號(hào)：327512