[目的]microRNA-218（miR-218）是一種重要的抑瘤微小RNA（miRNA）,其表達(dá)異�？梢娪诙喾N實體腫瘤及癌前病變。本室前期研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤miR-218表達(dá)水平隨其良惡性程度升高而相應(yīng)降低,提示其表達(dá)減少或缺失可能在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。生物信息學(xué)預(yù)測顯示細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）是miR-218的潛在靶基因,且膠質(zhì)瘤CDK6表達(dá)水平隨其良惡性程度升高而相應(yīng)增加,但在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中二者表達(dá)變化的確切關(guān)系如何,尚待進(jìn)一步證實。本研究旨在觀察miR-218在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲及誘導(dǎo)細(xì)胞成熟分化方面的作用,證實CDK6是否miR-218的天然靶基因,探討miR-218特異性敲低CDK6表達(dá)是否是該miRNA發(fā)揮抑瘤作用的分子機制。[方法]①通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和G418篩選建立過表達(dá)miR-218的U87MG和SNB-19亞細(xì)胞系及對照亞細(xì)胞系,采用stem-loop qRT-PCR比較各亞細(xì)胞系中miR-218的表達(dá)水平。②采用熒光素酶實驗、qRT-PCR及Western blot驗證CDK6是否是miR-218的天然靶基因,探討miR-218敲... 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學(xué)天津市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略語/符號說明
前言
    研究現(xiàn)狀、成果
    研究目的、方法
材料與方法
    1. 主要實驗儀器
    2. 實驗材料
        2.1 細(xì)胞系
        2.2 引物、DNA合成序列及重組質(zhì)粒
        2.3 主要試劑
    3. 實驗方法
        3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和亞細(xì)胞系的篩選
            3.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            3.1.2 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的準(zhǔn)備
            3.1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            3.1.4 穩(wěn)定亞細(xì)胞系的篩選
        3.2 各亞細(xì)胞系miR-218表達(dá)水平的檢測
            3.2.1 總RNA的提取
            3.2.2 miR-218表達(dá)水平的qRT-PCR檢測
        3.3 熒光素酶實驗
            3.3.1 重組熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            3.3.2 細(xì)胞分組及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
            3.3.3 熒光素酶活性檢測
        3.4 Western blot檢測
            3.4.1 分組及細(xì)胞總蛋白的提取
            3.4.2 SDS-PAGE
            3.4.3 免疫印漬
        3.5 CDK6 mRNA的qRT-PCR檢測
            3.5.1 分組及總RNA樣品
            3.5.2 檢測過程
        3.6 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測
            3.6.1 分組及細(xì)胞鋪片的制備
            3.6.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色
            3.6.3 結(jié)果判讀
        3.7 細(xì)胞周期檢測
        3.8 體外克隆形成實驗
        3.9 凋亡檢測
            3.9.1 Caspase 3/7生物活性檢測
            3.9.2 FCM凋亡檢測
        3.10 遷移侵襲實驗
            3.10.1 體外遷移侵襲實驗
            3.10.2 定量侵襲實驗
        3.11 Matrigel 3D培養(yǎng)
        3.12 免疫熒光檢測
        3.13 統(tǒng)計學(xué)方法
結(jié)果
    1. 穩(wěn)定過表達(dá)miR-218及無義對照序列的亞細(xì)胞系的建立
    2. miR-218可在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中直接抑制CDK6的表達(dá)
        2.1 重組熒光素酶報導(dǎo)基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2 熒光素酶實驗結(jié)果
        2.3 miR-218可在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中抑制CDK6的表達(dá)
    3. miR-218可有效抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的增殖
        3.1 各膠質(zhì)母細(xì)胞瘤亞細(xì)胞系細(xì)胞增殖活性的比較
        3.2 miR-218可顯著降低SNB-19細(xì)胞系的克隆形成效率
        3.3 miR-218可誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的G_1期阻滯
    4. miR-218可誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的凋亡
        4.1 各膠質(zhì)母細(xì)胞瘤亞細(xì)胞系Caspase 3/7生物活性的比較
        4.2 miR-218可明顯提高U87MG及SNB-19細(xì)胞的凋亡指數(shù)
    5. miR-218可抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力
        5.1 各膠質(zhì)母細(xì)胞瘤亞細(xì)胞系遷移和侵襲能力的比較
        5.2 miR-218對U87MG及SNB-19細(xì)胞侵襲能力影響的定量檢測結(jié)果
        5.3 各膠質(zhì)母細(xì)胞瘤亞細(xì)胞系Matrigel 3D培養(yǎng)結(jié)果
    6. miR-218可促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的成熟分化
        6.1 各膠質(zhì)母細(xì)胞瘤亞細(xì)胞系CD133及Nestin表達(dá)水平的比較
        6.2 各膠質(zhì)母細(xì)胞瘤亞細(xì)胞系GFAP LI的比較
        6.3 CD133及Nestin表達(dá)的免疫熒光檢測結(jié)果
討論
    1. miR-218可通過誘導(dǎo)G_1期阻滯有效抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖
    2. miR-218可阻斷CDK6的表達(dá)
    3. miR-218可誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡
    4. miR-218可通過阻斷CDK6表達(dá)抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移侵襲
    5. miR-218可通過阻斷CDK6表達(dá)誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的成熟分化
    6. 結(jié)束語
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
發(fā)表論文和參加科研情況說明
綜述
    綜述參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]膠質(zhì)瘤miR-218與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6表達(dá)的相互關(guān)系及其對腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J]. 張景敏,孫翠云,于士柱,王虔,安同嶺,李艷艷,孔妍玲,溫艷軍.  中華病理學(xué)雜志. 2011 (07)



本文編號：3266640