背景：帕金森�。≒arkinson’s disease, PD）是臨床上常見的神經(jīng)退行性疾病之一。PD的臨床表現(xiàn)主要為靜止性震顫、運動遲緩、步態(tài)異常和肌強直,PD的病因與發(fā)病機制尚無確切定論,主流研究認(rèn)為這是一種與衰老、環(huán)境及遺傳因素密切相關(guān)的疾病。PINK1基因（PTEN-induced putative kinase1）是在2004年被克隆的PARK6致病基因,屬于常染色體隱性遺傳早發(fā)性帕金森綜合征的致病基因之一,該基因編碼產(chǎn)生一種由581個氨基酸組成有激酶活性的線粒體蛋白,包括一個由34個氨基酸組成的線粒體定位結(jié)構(gòu)域和一個由354個氨基酸組成的激酶結(jié)構(gòu)域,此激酶結(jié)構(gòu)域與Ca2+/鈣調(diào)蛋白家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶高度同源。PINK1蛋白首先于2003年被證明它的激酶區(qū)域在體外實驗中有自磷酸化活性,PINK1蛋白能通過自身磷酸化后,調(diào)節(jié)其自身的激酶活性；PINK1蛋白也能參與體外磷酸化,如磷酸化組蛋白H1或酪蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)PINK1基因的致病突變影響了PINK1蛋白的磷酸化。但未有PINK1蛋白自身磷酸化位點體外實驗的鑒定研究報道,及PINK1蛋白的自身磷酸化修飾位點改變對其體外激... 

【文章來源】：中南大學(xué)湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：139 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
目錄
前言
第一節(jié) 應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)鑒定PINK1蛋白自磷酸化修飾位點的研究
    1 材料與儀器
        1.1 主要儀器
        1.2 主要試劑、耗材及試劑的配制
    2 實驗方法
        2.1 野生型PINK1原核表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建
        2.2 大腸桿菌中蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)
        2.3 平衡G4B（Glutathione Sepharose 4B）
        2.4 GST蛋白的純化
        2.5 蛋白質(zhì)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）
        2.6 GST-Tag融合蛋白的大量純化
        2.7 體外磷酸化反應(yīng)（In Vitro Phosphorylation Assay）
        2.8 生物質(zhì)譜技術(shù)（北京蛋白質(zhì)組研究中心）檢測磷酸化修飾位點
    3 結(jié)果
        3.1 構(gòu)建野生型PFNK1的原核表達(dá)質(zhì)粒
        3.2 GST-PINK1融合蛋白的大量純化
        3.3 運用質(zhì)譜技術(shù)鑒定PINK1蛋白的自身磷酸化修飾位點
    4 分析與討論
第二節(jié) 野生型PINK1蛋白自身磷酸化修飾的研究
    1 材料與儀器
        1.1 主要儀器
        1.2 主要試劑、耗材及試劑的配制
    2 實驗方法
        2.1 S465A突變型PINK1原核表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建（TaKaRa MutanBEST Kit）
        2.2 大腸桿菌中蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)
        2.3 平衡G4B（Glutathione Sepharose 4B）
        2.4 GST蛋白的純化
        2.5 蛋白質(zhì)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）
        2.6 GST-Tag融合蛋白的大量純化
        2.7 體外磷酸化反應(yīng)（In Vitro Phosphorylation Assay）和放射自顯影
        2.8 實驗分組
        2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析
    3 結(jié)果
        3.1 構(gòu)建S465A突變型PINK1的原核表達(dá)質(zhì)粒
        3.2 GST-PINK1融合蛋白的大量純化
        3.3 體外磷酸化和放射自顯影
    4 分析與討論
第三節(jié) 突變型PINK1蛋白對其激酶活性的影響
    1 材料與儀器
        1.1 主要儀器
        1.2 主要試劑、耗材及試劑的配制
    2 實驗方法
        2.1 T313M、R492X突變型PINK1原核表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建
        2.2 大腸桿菌中蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)
        2.3 平衡G4B（Glutathione Sepharose 4B）
        2.4 GST蛋白的純化
        2.5 蛋白質(zhì)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）
        2.6 GST-Tag融合蛋白的大量純化
        2.7 體外磷酸化反應(yīng)（In Vitro Phosphorylation Assay）和放射自顯影
        2.8 實驗分組
        2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析
    3 結(jié)果
        3.1 構(gòu)建T313M、R492X突變型PINK1的原核表達(dá)質(zhì)粒
        3.2 野生型及突變型GST-PINK1融合蛋白的大量純化
        3.3 野生型和突變型GST-PINK1融合蛋白磷酸化底物酪蛋白的活性的比較
    4 分析與討論
第四節(jié) 突變型PINK1蛋白對于亞細(xì)胞定位的影響
    1 材料與儀器
        1.1 主要儀器
        1.2 主要試劑、耗材及試劑的配制
    2 實驗方法
        2.1 S465A/S465D突變型PINK1真核表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建
        2.2 HEK 293細(xì)胞培養(yǎng)
        2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染（脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法）
        2.4 實驗分組
        2.5 細(xì)胞免疫化學(xué)染色
        2.6 細(xì)胞的熒光觀察
    3 結(jié)果
        3.1 構(gòu)建S465D突變型PINK1的原核表達(dá)質(zhì)粒
        3.2 構(gòu)建S465A/S465D突變型PINK1的真核表達(dá)質(zhì)粒
        3.3 在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果
    4 分析與討論
第五節(jié) 突變型PINK1蛋白對于其自身降解的影響
    1 材料與儀器
        1.1 主要儀器
        1.2 材料與試劑
    2 實驗方法
        2.1 HEK 293細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染（脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法）
        2.3 實驗分組
        2.4 Chase-time
        2.5 Western-blotting
    3 結(jié)果
    4 分析與討論
第六節(jié) 突變型PINK1對于Parkin亞細(xì)胞定位的影響
    1 材料與儀器
        1.1 主要儀器
        1.2 主要試劑、耗材及試劑的配制
    2 實驗方法
        2.1 HEK 293細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染（脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法）
        2.3 實驗分組
        2.4 細(xì)胞免疫化學(xué)染色
        2.5 細(xì)胞的熒光觀察
        2.6 共轉(zhuǎn)染后含有野生型及突變型PINK1與Parkin共定位的陽性細(xì)胞計數(shù)
    3 結(jié)果
        3.1 熒光顯微鏡下觀察共轉(zhuǎn)染后野生型及突變型PINK1與Parkin的亞細(xì)胞定位
        3.2 共轉(zhuǎn)染后含野生型及突變型PINK1與Parkin共定位的陽性細(xì)胞計數(shù)統(tǒng)計
    4 分析與討論
結(jié)論
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學(xué)位期間的主要研究成果目錄
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]帕金森病相關(guān)蛋白Parkin與PINK1的相互作用研究[J]. 王雪晶,郭紀(jì)鋒,江泓,沈璐,唐北沙.  生物化學(xué)與生物物理進展. 2010(09)
[2]帕金森病的診斷[J]. 張振馨.  中華神經(jīng)科雜志. 2006(06)
[3]常染色體隱性遺傳早發(fā)性帕金森綜合征致病基因的突變分析[J]. 嚴(yán)新翔,張玉虎,郭紀(jì)鋒,李靜,夏昆,蔡芳,潘乾,龍志高,陳濤,曹立,沈璐,江泓,趙國華,唐北沙.  中華神經(jīng)科雜志. 2005(06)
[4]常染色體隱性遺傳早發(fā)性帕金森綜合征6型PINK1基因的突變分析[J]. 張玉虎,唐北沙,郭紀(jì)鋒,夏昆,許波,蔡芳,鄧漢湘,嚴(yán)新翔,陳濤,曹立,潘乾,龍志高.  中華醫(yī)學(xué)雜志. 2005(22)



本文編號：3065891