發(fā)布時(shí)間：2017-04-13 22:06

  本文關(guān)鍵詞：IL-33在蛛網(wǎng)膜下腔出血后大鼠腦組織中的表達(dá)及在炎癥反應(yīng)中的可能作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分題目：IL-33在SAH后的表達(dá)、定位及可能作用研究背景：蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)特別是動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血是一種高發(fā)病,高致死、致殘的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾�。皇桥R床三大腦血管疾病之一,約占到所有腦卒中的5%；國(guó)外統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)大約有12%的SAH患者在就醫(yī)前就已經(jīng)死亡,另外在SAH患者中大約有30%的病人在發(fā)病后2天內(nèi)死亡,大約40%的病人在發(fā)病后1個(gè)月內(nèi)死亡；即使患者能存活下來,也有大約20%的患者會(huì)出現(xiàn)終生的神經(jīng)功能障礙,超過1/3的患者生活不能自理。并且在動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血患者中,第一次破裂出血后如得不到有效的治療,2周內(nèi)再出血概率為12%,再出血死亡率可高達(dá)到72%。現(xiàn)研究認(rèn)為SAH后3d內(nèi)發(fā)生的早期腦損傷(early brain injury, EBI)對(duì)SAH患者的預(yù)后有著重要的影響；SAH早期腦損傷的機(jī)制包括：1顱內(nèi)壓的升高、腦組織血流灌注量的減少；2急性腦血管痙攣；3血腦屏障(BBB)的破壞；4炎癥及凋亡反應(yīng)；5血紅蛋白及其代謝產(chǎn)物的毒性：6腦水腫等；這些都是近年來研究的熱點(diǎn)。白介素33(Interleukin-33, IL-33)是白介素1(Interleukin-1, IL-1)家族的新成員,它的分子量為30kDa：因其具有IL-1家族所固有的結(jié)構(gòu)域,因此IL-33被歸類為IL-1家族。白介素1(IL-1)家族是一類前炎癥細(xì)胞因子與中樞神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)系密切。不同的白介素1家族成員在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作用不同,有時(shí)甚至表現(xiàn)出相反的作用。而IL-33作為IL-1家族的新成員,它與中樞神經(jīng)系統(tǒng)也可能存在相關(guān)性,但是這種相關(guān)性現(xiàn)在還明確。IL-33在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中呈高分布狀態(tài),目前有研究認(rèn)為被激活的具有完整生物學(xué)功能的IL-33是細(xì)胞對(duì)胞外危險(xiǎn)環(huán)境的反應(yīng)信號(hào)；IL-33在未激活前是以前體形式存在的,在受到刺激后需經(jīng)過剪切修飾后才進(jìn)行釋放,但是IL-33的激活與修飾釋放過程現(xiàn)在還是不清楚的；現(xiàn)在認(rèn)為IL-33的剪切修飾很可能與半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase:caspase)家族有關(guān)�？扇苄許T2(sST2).ST2V和跨膜受體ST2(ST2L)是lL-33的主要受體,其中sST2被認(rèn)為是IL-33的誘騙受體,可與ST2L競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IL-33,起拮抗劑作用。ST2L是IL-33主要的功能受體,主要由Th2細(xì)胞、干細(xì)胞和NKT細(xì)胞分泌；在反應(yīng)中IL-33與ST2結(jié)合后再與IL-1受體輔助蛋白(IL-1RAcp)結(jié)合形成三聚體受體復(fù)合物,其中ST2與配體IL-33結(jié)合,IL-1RAcp將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、傳入細(xì)胞內(nèi),激活相關(guān)信使與蛋白,最終引起髓樣初級(jí)反應(yīng)蛋白88(MyD88)、白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶-1/4(IRAK-1/4)的聚集,激活下游的核因子-κB(NF-κB)和絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)的信號(hào)通路,MAPK通路可以激活下游的信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK),p38等因子；NF-κB通路可激活相關(guān)的炎癥反應(yīng)因子如白介素-1β(IL-Iβ)、腫瘤壞死因子.-α(TNF-α)�，F(xiàn)研究認(rèn)為IL-33是一多功能的因子,參與多種病理反應(yīng)過程,在不同的系統(tǒng)中可以起到不同的作用：如在心血管系統(tǒng)中起心肌保護(hù)作用；在消化系統(tǒng)中起減輕炎癥作用；而在呼吸系統(tǒng)炎癥中卻起到加重炎癥反應(yīng)的作用；但大多數(shù)研究均認(rèn)為IL-33可參與相關(guān)炎癥反應(yīng)的病理過程,而炎癥反應(yīng)在SAH后病理反應(yīng)中起著重要作用,并且IL-33在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá),因此我們推測(cè)IL-33有可能參與SAH后的炎癥反應(yīng)過程。目的：本實(shí)驗(yàn)主要目的為檢測(cè)IL-33的在SAH后的表達(dá)和定位情況,并探討IL-33在SAH后可能作用。方法：1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：使用成年雄性Sprague-Dawly大鼠,大小約為280-320g按隨機(jī)方法分為空白對(duì)照組和SAH組,其中SAH組又分為SAH模型建立后2h、6h、12h、1d、2d、3d、5d7組。2.SAH模型制作和組織的獲取：采用視交叉前池注血模型,在相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)處死大鼠,選取視交叉前池有積血點(diǎn)的大鼠取顳葉皮質(zhì)為標(biāo)本。3. Western blot analysis:利用凝膠電泳分離總蛋白,以檢測(cè)空白對(duì)照組和蛛網(wǎng)膜下腔出血組各時(shí)間點(diǎn)組IL-33、MyD88總蛋白的表達(dá)情況。利用凝膠電泳分離核蛋白,以檢測(cè)在空白對(duì)照組和蛛網(wǎng)膜下腔出血組各時(shí)間點(diǎn)組NF-κB亞單位P65核蛋白的表達(dá)情況。4. RT-PCR analysis:利用RNA提取試劑盒提取大鼠顳葉皮層腦組織的RNA,并進(jìn)行定量分析；在使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用試劑盒并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng),以檢測(cè)在空白對(duì)照組和蛛網(wǎng)膜下腔出血組各時(shí)間點(diǎn)大鼠顳葉皮層中IL-33和IL-1β mRNA表達(dá)情況。5.免疫組化染色：制作組織切片,利用免疫組化染色方法檢測(cè)在空白對(duì)照組和蛛網(wǎng)膜下腔出血后1天在大鼠顳葉皮層中IL-33表達(dá)量的變化,及IL-33在細(xì)胞內(nèi)定位的情況。6.免疫熒光雙染：制備組織冰凍切片,利用免疫熒光雙染方法檢測(cè)空白對(duì)照組和蛛網(wǎng)膜下腔出血后1天IL-33在神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)和分布情況7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,所有定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±SEM)表示。多組均數(shù)比較先采用單因素方差分析,接著采用Dunnett-t檢驗(yàn),均以p0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。行相關(guān)性分析時(shí)使用Linear regression分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以p0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)量分析：實(shí)驗(yàn)過程中空白組模型制作成功率100%,SAH組模型制作成功率75%；另外SAH組大鼠死亡率、視交叉前池?zé)o積血點(diǎn)比率分別為19.7%和6.8%。2.SAH引起大鼠大腦皮質(zhì)中IL-33蛋白水平升高：IL-33蛋白水平在正常大鼠大腦顳葉皮質(zhì)中呈低表達(dá)狀態(tài),SAH引起大鼠大腦皮質(zhì)中IL-33蛋白水平升高,在24小時(shí)出現(xiàn)峰點(diǎn)。與空白對(duì)照組相比,SAH后6h、12h、1d、2d、3d IL-33的蛋白水平有顯著升高(p0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.SAH引起大鼠大腦皮質(zhì)中IL-33 mRNA、IL-1β mRNA水平升高,并且兩者mRNA的改變趨勢(shì)具有正相關(guān)：與對(duì)照組相比較,SAH后6h、12小時(shí)、1天、2天、3天的IL-33 mRNA水平顯著升高(p0.05),在24小時(shí)出現(xiàn)峰點(diǎn).；而IL-1β mRNA水平在SAH后1天、3天、5天有顯著性升高(p0.05),也在24小時(shí)出現(xiàn)峰點(diǎn)。行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)兩者變化趨勢(shì)存在正相關(guān),r=0.50,p0.05。4.免疫組化示SAH后IL-33表達(dá)增多,IL-33定位于細(xì)胞核與細(xì)胞漿中：與空白對(duì)照組相比較在SAH后1天IL-33表達(dá)量增多(p0.05),IL-33細(xì)胞陽(yáng)性率分別為34.8%和67.9%；并且SAH后IL-33在細(xì)胞漿及細(xì)胞核中均有表達(dá)。5.IL-33在神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞中有表達(dá),在小膠質(zhì)細(xì)胞中不表達(dá)：大鼠大腦皮質(zhì)中,在對(duì)照組和SAH后1天組中神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞均有IL-33的表達(dá),并且SAH引起IL-33表達(dá)量的升高(p0.05)。神經(jīng)元中SAH組與對(duì)照組IL-33細(xì)胞陽(yáng)性率分別為68.9%、46.4%；星形膠質(zhì)細(xì)胞中比率分別為：26.7%、14.1%。小膠質(zhì)細(xì)胞中無(wú)IL-33的表達(dá)。6.SAH引起大鼠大腦皮質(zhì)中總蛋白MyD88和核蛋白NF-κB p65蛋白水平升高,并且兩者蛋白含量變化趨勢(shì)與IL-33蛋白表達(dá)量的變化趨勢(shì)均具有正相關(guān)：SAH引起大鼠大腦皮質(zhì)中總蛋白MyD88和核蛋白NF-κB p65蛋白水平升高；與空白對(duì)照組相比,MyD88總蛋白在SAH后12h、1d、2d、3d、5d有顯著升高(p0.05); NF-κB p65核蛋白在SAH后12h、1d、2d、3d、5d有顯著升高(p0.05)；兩者均在1天出現(xiàn)峰點(diǎn)。行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)SAH后IL-33蛋白變化趨勢(shì)與MyD88總蛋白變化趨勢(shì)存在正相關(guān),r=0.57,p0.05;SAH后IL-33蛋白變化趨勢(shì)與NF-κBp65核蛋白變化趨勢(shì)存在正相關(guān)r=0.61,p0.05。結(jié)論：1、SAH引起IL-33表達(dá)的升高；2、IL-33定位在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞漿中；3、SAH后IL-33與IL-1β mRNA有正相關(guān),IL-33與MyD88、NF-κBp65蛋白變化有正相關(guān)。4、IL-33有可能通過IL-33→MyD88→NF-κB p65通路參與SAH后的炎癥反應(yīng)過程。第二部分題目：外源性IL-33在SAH后作用和可能作用機(jī)制研究背景：在第一部分試驗(yàn)中,我們初步檢測(cè)了IL-33在蛛網(wǎng)膜下腔出血后的表達(dá)及定位情況：我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)MyD88→NF-κB途徑可參與SAH后的炎癥反應(yīng),實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)SAH后IL-33分別與MyD88、NF-κB p65、 IL-1β變化有正相關(guān)；因此我們探討了IL-33通過IL-33→MyD88→NF-κB途徑參與SAH后的炎癥反應(yīng)的可能性；現(xiàn)為進(jìn)一步驗(yàn)證這種可能性,我們?cè)赟AH后予外源性IL-33,并檢測(cè)下游MyD88、NF-κB的變化情況,及腦水腫和神經(jīng)功能評(píng)分的變化。目的：本實(shí)驗(yàn)為檢測(cè)IL-33通過IL-33→MyD88→NF-κB途徑參與蛛網(wǎng)膜下腔出血后的炎癥反應(yīng)的可能性,及IL-33對(duì)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血預(yù)后的影響。方法：1.分組實(shí)及給藥：使用成年雄性Sprague-Dawly大鼠,大小約為280-320g；按隨機(jī)方法分為蛛網(wǎng)膜下腔出血組(SAH)、蛛網(wǎng)膜下腔出血+生理鹽水組(SAH+Vehicle)、蛛網(wǎng)膜下腔出血+低劑量外源性IL-33組(SAH+LOW IL-33)、蛛網(wǎng)膜下腔出血+高劑量外源性IL-33組(SAH+HIGH IL-33)。SAH+Vehicle組在SAH模型制作后半小時(shí)往視交叉前池注射無(wú)菌生理鹽水10ul; SAH+LOW IL-33組在SAH模型制作后半小時(shí)往視交叉前池注射外源性IL-33 30ng(溶于10ul生理鹽水中)；SAH+HIGH IL-33組在SAH模型制作后半小時(shí)往視交叉前池注射外源性IL-33 300ng(溶于10ul生理鹽水中)；SAH組模型制作后不再往視交叉前池注射任何液體。2.SAH模型制作和組織的獲取：采用視交叉前池注血模型,在模型制作后1天選取視交叉前池有積血點(diǎn)的大鼠取顳葉腦皮質(zhì)為標(biāo)本。3. Western blot analysis:用于檢測(cè)各組在蛛網(wǎng)膜下腔出血后1天MyD88總蛋白和NF-κB p65核蛋白的改變情況。4. RT-PCR analysis:用于檢測(cè)各組在蛛網(wǎng)膜下腔出血后1天MyD88和IL-1βmRNA的改變情況。5.神經(jīng)功能評(píng)分：在各組造模后24小時(shí),進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,本實(shí)驗(yàn)使用Garcia評(píng)分系統(tǒng),該評(píng)分最高評(píng)18分,最低3分；用于評(píng)估各組大鼠SAH的嚴(yán)重程度。6.腦水腫測(cè)定：在蛛網(wǎng)膜下腔出血模型制作后1天處死大鼠,測(cè)定腦水腫,計(jì)算方法為([濕重-干重]/濕重]×100%)；用于評(píng)估大鼠腦水腫嚴(yán)重程度。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,所有定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±SEM)表示,多組均數(shù)比較先采用單因素方差分析,接采用Dunnett-t檢驗(yàn),均以p0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)量分析：本實(shí)驗(yàn)原計(jì)劃在使用48只大鼠,實(shí)際使用61只大鼠,在SAH組有3只大鼠死亡或者造模失敗,模型制作成功率為80%；在SAH+Vehicle組有4只大鼠死亡或者造模失敗,模型制作成功率為75%；在SAH+LOWIL-33組有4只大鼠死亡或者造模失敗,模型制作成功率為75%；在SAH+HIGHIL-33組有2只大鼠死亡或者造模失敗,模型制作成功率為85%.2.SAH后外源性IL-33引起大鼠大腦皮質(zhì)中MyD88總蛋白表達(dá)量的升高：與SAH組相比SAH+Vehicle組MyD88總蛋白水平的改變并無(wú)顯著性差異；與SAH組相比,SAH+LOW IL-33組與SAH+HIGH IL-33組MyD88總蛋白水平有顯著升高(p0.05)。3.SAH后外源性IL-33引起大鼠大腦皮質(zhì)中NF-κB p65核蛋白表達(dá)量的升高：與SAH組相比較SAH+HIGH IL-33組NF-κB核蛋白有顯著性升高(p0.05)。與SAH組相比SAH+Vehicle組與SAH+LOW IL-33組NF-κB核蛋白含量的改變并無(wú)顯著性差異。4.SAH后外源性IL-33引起大鼠大腦皮質(zhì)中MyD88. IL-1βmRNA水平提高：與SAH組相比SAH+LOW IL-33組和SAH+HIGH IL-33組MyD88 mRNA水平有顯著性提高(p0.05),SAH+Vehicle組無(wú)顯著性差異；與SAH組相比SAH+LOW IL-33組和SAH+HIGH IL-33組IL-1β mRNA水平有顯著性提高(pn05),SAH+Vehicle組無(wú)顯著性差異。5.SAH后外源性IL-33引起大鼠神經(jīng)功能評(píng)分降低：與SAH組相比SAH+HIGH IL-33組神經(jīng)功能評(píng)分有顯著性降低(p0.05),SAH+Vehicle組、SAH+LOW IL-33組無(wú)顯著性差異。6.SAH后外源性IL-33加重大鼠腦水腫：與SAH組相比SAH+LOW IL-33組和SAH+HIGH IL-33組腦水腫顯著性加重(p0.05)。與SAH組相比SAH+Vehicle組腦水腫無(wú)顯著性差異。結(jié)論：1.SAH后外源性IL-33可引起MyD88總蛋白、NF-κB p65核蛋白表達(dá)量的升高2.SAH后外源性IL-33引起大鼠大腦皮質(zhì)中MyD88mRNA, IL-1βmRNA水平提高3.IL-33可通過IL-33→MyD88→NF-κB通路參與SAH后的炎癥反應(yīng)過程4.IL-33可能引起大鼠SAH的不良預(yù)后。
【關(guān)鍵詞】：蛛網(wǎng)膜下腔出血 外源性白介素33 通路 蛛網(wǎng)膜下腔出血 白介素33 表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R743.35
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-19
• 第一部分：IL-33在SAH后的表達(dá)、定位及可能作用19-49
• 1. 背景19-27
• 2. 材料與方法27-35
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-45
• 4. 討論45-49
• 第二部分 外源性IL-33在SAH后的作用和可能作用機(jī)制49-61
• 1. 背景49
• 2. 材料與方法49-54
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果54-59
• 4. 討論59-61
• 參考文獻(xiàn)61-68
• 全文小結(jié)68-69
• 綜述：IL-33與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)系69-76
• 參考文獻(xiàn)73-76
• 英文縮略詞表76-77
• 攻讀學(xué)位期間成果77-78
• 致謝78-79

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：304565