鞘糖脂分子葡萄糖神經(jīng)酰胺（GluCer）與半乳糖神經(jīng)酰胺（GalCer）,葡萄糖鞘氨醇（GluSph）和半乳糖鞘氨醇（GalSph）分別為異構(gòu)體。它們均具有細(xì)胞毒性,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中積累會(huì)導(dǎo)致溶酶體貯積疾病如戈謝病和克拉伯病,也被證實(shí)與帕金森氏病和路易體病密切相關(guān)。研究CNS中鞘糖脂對(duì)神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域具有重要意義。在本文中,我們改進(jìn)了基于親和色譜柱的一種液相色譜方法,設(shè)計(jì)了一個(gè)新穎的梯度,可在10 min內(nèi)同時(shí)分離檢測(cè)GluCer/GalCer及GluSph/GalSp異構(gòu)體。而且,該梯度在每次運(yùn)行后重新活化分離柱,可將靈敏度（相對(duì)等度洗脫）提高一個(gè)數(shù)量級(jí)。本方法成功用于分析疾病小鼠模型的生物樣品（包括細(xì)胞、腦脊髓液、血漿和腦）中的糖鞘脂,結(jié)果表明鞘糖脂可作為研究相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的高靈敏生物標(biāo)志物。 

【文章來(lái)源】：分析科學(xué)學(xué)報(bào). 2020,36(05)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【部分圖文】：

(A)LC梯度;(B)小鼠CSF的6種GluCer和GalCer;(C)小鼠CSF的GluSph和GalSph;(D)等度運(yùn)行,色譜柱靈敏度在分析35個(gè)樣品后降至10%左右(采用本實(shí)驗(yàn)的梯度,柱效在20多個(gè)樣品后基本完全恢復(fù));(E)內(nèi)標(biāo)物L(fēng)C峰強(qiáng)度對(duì)比

2.2 疾病模型小鼠與野生小鼠中GluSph和GalSph含量對(duì)比我們研究了幾種疾病小鼠模型及野生型小鼠的生物樣品,其中包括β -葡糖苷酶抑制劑(CBE)注射的小鼠腦組織,GBA敲除小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和自然突變的twitcher小鼠的血漿,CBE小鼠和GBA敲除模型用于研究戈謝病(GD)或者帕金森。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在注射10周CBE雄性小鼠的腦中GluSph含量比野生型小鼠腦中上升超過(guò)百倍,而GalSph幾乎沒(méi)有變化(圖2a和2g)。在GBA敲除的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,GluSph和GalSph沒(méi)有明顯變化(圖2d和2e)。證實(shí)了β -葡糖苷酶GCase的缺失,極大的影響CNS。但在基因敲除的動(dòng)物體外實(shí)驗(yàn),GCase的抑制尚未達(dá)到明顯效果。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)12周的twitcher小鼠的血漿中,相對(duì)于野生型GalSph增加了近百倍,而GluSph完全沒(méi)有受到影響(圖2b和2c)。充分說(shuō)明twitcher小鼠模型中GALC的突變,以及這個(gè)模型用于研究克拉伯病的有效性,同時(shí)說(shuō)明這些酯類(lèi)作為疾病通路標(biāo)志物的可能性[16,17]。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和靈敏度圖3顯示GluCer(d18∶1/18∶0)相對(duì)于2 000 pg內(nèi)標(biāo)(即加入每個(gè)樣品的內(nèi)標(biāo)總量,見(jiàn)1.4節(jié)),GluCer(d18∶1/18∶0)-d5從3.8 pg到15 625 pg的標(biāo)準(zhǔn)曲線(進(jìn)樣體積5 μL)。結(jié)果表明新建立方法的線性范圍很寬,達(dá)到4個(gè)數(shù)量級(jí),相關(guān)系數(shù)R2>0.995,定量限達(dá)10 pg,檢出限低至3 pg。濃度分別為12 000、1 200及50 pg的高、中、低質(zhì)控樣品,測(cè)量準(zhǔn)確率不低于85%。脂類(lèi)的質(zhì)譜分析中,基于同一類(lèi)脂離子化效率大致相同,往往使用單一內(nèi)標(biāo)來(lái)定量不同長(zhǎng)度脂肪酸鏈的分子以減少摻入內(nèi)標(biāo)的可能干擾。實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)葡萄糖和半乳糖神經(jīng)酰胺離子化效率也近似相同,故而這個(gè)曲線被用于本文中所有的GluCer和GalCer分子定量。文獻(xiàn)報(bào)道GD模型CSF的含量為280 pmol/mL[18],故5 μL小鼠CSF中GluCer含量約為980 pg。CSF萃取過(guò)程是將5 μL 樣品稀釋到50 μL,再進(jìn)樣5 μL,所以進(jìn)樣量為CSF的1/10。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)樣的GluCer含量約為110 pg,CSF中含量約為1 100 pg,此濃度略高于報(bào)道的濃度,遠(yuǎn)高于我們的定量限(10 pg)。說(shuō)明了我們新建立的方法的靈敏度很高,而且適用性強(qiáng),適用于檢測(cè)低至5 μL的CSF或者20 mg組織中GluCer及GalCer含量。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]糖鞘脂分析技術(shù)及相關(guān)疾病研究進(jìn)展[J]. 杜昊騏,于漢杰,賈麗苑,李錚.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2016(01)



本文編號(hào)：3026700