神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生經(jīng)常伴隨著神經(jīng)細(xì)胞中蛋白聚集體沉積以及線粒體功能異常。這兩個現(xiàn)象之間是否有直接聯(lián)系仍然不是很清楚。Tom40是線粒體外膜運(yùn)入復(fù)合體的重要組成部分。本研究發(fā)現(xiàn),Tom40表達(dá)水平的下降導(dǎo)致胞質(zhì)中積累大量泛素（ubiquitin,Ub）標(biāo)記的蛋白聚集體。這些聚集體被細(xì)胞自噬標(biāo)記分子Atg8a陽性的膜結(jié)構(gòu)所包裹。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),其他的自噬通路標(biāo)志分子在胞質(zhì)中也產(chǎn)生異常的積累。當(dāng)Tom40表達(dá)水平下降,細(xì)胞內(nèi)自噬過程被誘導(dǎo),但是自噬體與溶酶體之間融合過程發(fā)生障礙。通過對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),Tom40 RNAi細(xì)胞中產(chǎn)生巨型自噬體樣（autophagosome-like,AL）結(jié)構(gòu),其直徑是經(jīng)饑餓誘導(dǎo)產(chǎn)生自噬體直徑的10倍左右。這些巨型自噬體樣結(jié)構(gòu)通常不是完全封閉的。當(dāng)在Tom40 RNAi細(xì)胞中同時敲減Atg5基因,可以阻止自噬體樣結(jié)構(gòu)的形成,但是泛素標(biāo)記蛋白聚集體仍然存在。Syx17對于自噬體-溶酶體融合過程是必須的,在Tom40 RNAi細(xì)胞中同時敲減Syx17基因,導(dǎo)致巨型自噬體樣結(jié)構(gòu)消失,泛素標(biāo)記的蛋白聚集體周圍有小的自噬體結(jié)構(gòu)和隔離膜（phagophore）積累... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
中文摘要
Abstract
縮略詞表
1 引言
    1.1 線粒體與神經(jīng)性退行性疾病
    1.2 線粒體蛋白運(yùn)入系統(tǒng)
    1.3 線粒體蛋白運(yùn)入系統(tǒng)與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系
2 實驗材料和方法
    2.1 主要儀器和設(shè)備
    2.2 抗體
    2.3 動物實驗
        2.3.1 敲除果蠅的獲得
        2.3.2 轉(zhuǎn)基因果蠅的獲得
        2.3.3 成年果蠅爬行力測試
        2.3.4 果蠅饑餓實驗
    2.4 果蠅組織形態(tài)學(xué)實驗
        2.4.1 免疫熒光染色
        2.4.2 Lysotracker Red染色
        2.4.3 Phalloidin染色
        2.4.4 透射電鏡分析
    2.5 分子生物學(xué)實驗
        2.5.1 gRNA和Cas9 mRNA體外轉(zhuǎn)錄
        2.5.2 果蠅基因型鑒定
        2.5.3 果蠅組織RNA提取和熒光實時定量PCR
        2.5.4 轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建
    2.6 生化實驗
        2.6.1 果蠅組織Western blot
        2.6.2 ROS水平檢測
        2.6.3 ATP水平檢測
        2.6.4 果蠅蛋白質(zhì)譜鑒定
    2.7 統(tǒng)計分析
3 實驗結(jié)果
    3.1 Tom40缺失引起自噬功能的異常
    3.2 蛋白聚集體形成和自噬異常的表型不是線粒體功能異常后的普遍反應(yīng)
    3.3 Tom40缺失導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體前體蛋白的命運(yùn)不同
    3.4 Tom40缺失引起蛋白酶體活性下降
    3.5 抑制自噬過程可以引起蛋白聚集體變小和阻滯隔離膜對底物的包裹
    3.6 Ref（2）P RNAi和Pink1/Park過表達(dá)清除胞質(zhì)中的蛋白聚集體
    3.7 Tom40缺失引起神經(jīng)退行性變化
4 討論
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄一 果蠅基因型
    附錄二 果蠅品系信息
    附錄三 引物序列
作者簡歷



本文編號：2923063