神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生經(jīng)常伴隨著神經(jīng)細胞中蛋白聚集體沉積以及線粒體功能異常。這兩個現(xiàn)象之間是否有直接聯(lián)系仍然不是很清楚。Tom40是線粒體外膜運入復合體的重要組成部分。本研究發(fā)現(xiàn),Tom40表達水平的下降導致胞質中積累大量泛素（ubiquitin,Ub）標記的蛋白聚集體。這些聚集體被細胞自噬標記分子Atg8a陽性的膜結構所包裹。進一步研究發(fā)現(xiàn),其他的自噬通路標志分子在胞質中也產(chǎn)生異常的積累。當Tom40表達水平下降,細胞內自噬過程被誘導,但是自噬體與溶酶體之間融合過程發(fā)生障礙。通過對細胞超微結構分析發(fā)現(xiàn),Tom40 RNAi細胞中產(chǎn)生巨型自噬體樣（autophagosome-like,AL）結構,其直徑是經(jīng)饑餓誘導產(chǎn)生自噬體直徑的10倍左右。這些巨型自噬體樣結構通常不是完全封閉的。當在Tom40 RNAi細胞中同時敲減Atg5基因,可以阻止自噬體樣結構的形成,但是泛素標記蛋白聚集體仍然存在。Syx17對于自噬體-溶酶體融合過程是必須的,在Tom40 RNAi細胞中同時敲減Syx17基因,導致巨型自噬體樣結構消失,泛素標記的蛋白聚集體周圍有小的自噬體結構和隔離膜（phagophore）積累... 

【文章來源】：浙江大學浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

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中文摘要
Abstract
縮略詞表
1 引言
    1.1 線粒體與神經(jīng)性退行性疾病
    1.2 線粒體蛋白運入系統(tǒng)
    1.3 線粒體蛋白運入系統(tǒng)與神經(jīng)退行性疾病的關系
2 實驗材料和方法
    2.1 主要儀器和設備
    2.2 抗體
    2.3 動物實驗
        2.3.1 敲除果蠅的獲得
        2.3.2 轉基因果蠅的獲得
        2.3.3 成年果蠅爬行力測試
        2.3.4 果蠅饑餓實驗
    2.4 果蠅組織形態(tài)學實驗
        2.4.1 免疫熒光染色
        2.4.2 Lysotracker Red染色
        2.4.3 Phalloidin染色
        2.4.4 透射電鏡分析
    2.5 分子生物學實驗
        2.5.1 gRNA和Cas9 mRNA體外轉錄
        2.5.2 果蠅基因型鑒定
        2.5.3 果蠅組織RNA提取和熒光實時定量PCR
        2.5.4 轉基因載體構建
    2.6 生化實驗
        2.6.1 果蠅組織Western blot
        2.6.2 ROS水平檢測
        2.6.3 ATP水平檢測
        2.6.4 果蠅蛋白質譜鑒定
    2.7 統(tǒng)計分析
3 實驗結果
    3.1 Tom40缺失引起自噬功能的異常
    3.2 蛋白聚集體形成和自噬異常的表型不是線粒體功能異常后的普遍反應
    3.3 Tom40缺失導致細胞內線粒體前體蛋白的命運不同
    3.4 Tom40缺失引起蛋白酶體活性下降
    3.5 抑制自噬過程可以引起蛋白聚集體變小和阻滯隔離膜對底物的包裹
    3.6 Ref（2）P RNAi和Pink1/Park過表達清除胞質中的蛋白聚集體
    3.7 Tom40缺失引起神經(jīng)退行性變化
4 討論
參考文獻
附錄
    附錄一 果蠅基因型
    附錄二 果蠅品系信息
    附錄三 引物序列
作者簡歷



本文編號：2923063