本文關(guān)鍵詞：外周血中血腦屏障損傷新型標(biāo)志物cBMECs檢測(cè)方法的建立和臨床應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：一、研究背景全球范圍內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病的致殘率一直居高不下,有調(diào)查顯示全世界有1/3的人將會(huì)有CNS損傷的可能,而且CNS損傷的概率隨年齡增加而增加。血腦屏障(BBB)是大腦中樞的天然保護(hù)傘,其形態(tài)、功能的微小改變皆能給病原入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)帶來(lái)可乘之機(jī),BBB相關(guān)的疾病所致的住院率和預(yù)后時(shí)間延長(zhǎng)均高于其他疾病。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),BBB的損傷在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的發(fā)生過(guò)程中有關(guān)鍵作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病往往伴隨BBB結(jié)構(gòu)和功能的劇烈變化。因此監(jiān)視、檢測(cè)BBB的形態(tài)、功能的細(xì)微變化可以預(yù)測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染損傷,對(duì)臨床早期診斷、治療有重要意義,也成為診斷、治療、預(yù)防CNS損傷相關(guān)疾病的重要突破點(diǎn)。BBB損傷的定量檢測(cè)曾經(jīng)是CNS損傷檢測(cè)的難點(diǎn)所在。成功分離和培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMECs,BBB的體外模型)使得BBB損傷的致病機(jī)制研究(感染及藥物所致)成為可能。過(guò)去幾十年間,學(xué)者們采用了許多體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)BBB的功能：循環(huán)血中的蛋白(如白蛋白)滲透進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的蛋白(如S100B)釋放入循環(huán)血等都用來(lái)檢測(cè)BBB損傷。雖然這些技術(shù)都利用了內(nèi)源性蛋白,但是BBB的破壞可能并非僅與某些特異性結(jié)果引起的蛋白水平改變相關(guān)。近來(lái)基于分子成像技術(shù)的MPI在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。雖然學(xué)者們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中使用了許多合成造影劑,但是很少能在活體動(dòng)物腦部得到穩(wěn)定結(jié)果。神經(jīng)影像技術(shù)的最大難題在于顯影劑很少能夠成功通過(guò)BBB。其他的技術(shù)包括注射染色,如依文思藍(lán)染色,注射進(jìn)入動(dòng)物模型來(lái)檢測(cè)BBB完整性。這些技術(shù)的共同缺憾在于它們都不能被無(wú)創(chuàng)地運(yùn)用于人體。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),外周血中循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(cECs)的多少可反映因心血管損傷和免疫疾病而引起的血管內(nèi)皮損傷程度,該技術(shù)因其新穎性和無(wú)創(chuàng)性備受關(guān)注。大多cECs定量程序都包括一道富集步驟：通過(guò)磁珠偶聯(lián)抗體進(jìn)行免疫磁性分離。在外周血中循環(huán)的內(nèi)皮細(xì)胞中,一些是終極分化的細(xì)胞(cECs),另外一些是前體樣細(xì)胞(EPCs),EPCs可能參與誘導(dǎo)引導(dǎo)至靶位點(diǎn)的新血管形成。這些文獻(xiàn)更多的講述cECs在病理?xiàng)l件下被大量檢測(cè)到,cECs可以作為血管損傷性疾病或某些免疫相關(guān)疾病的標(biāo)志物。由此我們得到啟發(fā),既然BBB主要由一種特殊的內(nèi)皮細(xì)胞(BMECs)組成,那么BBB受損后,脫落至循環(huán)中的BMECs,即cBMECs,可以看做是BBB損傷的生物標(biāo)志物�；贐BB損傷和CNS的長(zhǎng)期研究,我們假設(shè)cBMECs有成熟的BBB細(xì)胞型,在CNS的病理改變的腦微血管結(jié)構(gòu)中動(dòng)態(tài)脫落。外周血中的BMECs可以用實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)行檢測(cè),作為提示BBB損傷的生物標(biāo)志物。二、研究方法1、磁珠活化與UEAI相偶聯(lián)吸附外周血內(nèi)皮細(xì)胞稱取粘附素UEA-I溶于0.5M pH9.5硼酸鹽緩沖液中,以0.2mg/ml比例震蕩至充分溶解。加入等體積的濃度為4×108/mL的免疫磁珠,充分混勻后,置于室溫充分地顛倒震蕩,搖動(dòng)孵育24小時(shí),使免疫磁珠Dynabeads M-450 Tosylactivated與磁珠包被物Ulex europaeus I (UEA I) lectin充分接觸,形成穩(wěn)定連接復(fù)合物。經(jīng)過(guò)孵育,將混合物置于磁力架上,在磁力作用下用0.01Mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗,棄去上清,借助磁力保留免疫磁珠,洗滌三到五次為宜。棄去上清后的磁珠用含0.1%胎牛血清的0.01Mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液重懸,放于4℃保存過(guò)夜。次日取出置于4℃的磁珠懸液,放在磁力架上棄去上清液體,用含有5%胎牛血清的Hanks緩沖液重懸磁珠至4×108/mL待用。2、免疫磁珠吸附外周血樣本中的目的細(xì)胞應(yīng)用真空采血針采集肘正中靜脈血,采集2m1靜脈血加入EDTA抗凝管,并在采集后的24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行磁珠吸附。取2mL待測(cè)樣品外周血液與20mL含有5U肝素的磷酸鹽緩沖液與離心管中充分混合。將混合物放入離心機(jī),以3000rpm的轉(zhuǎn)數(shù)充分離心5分鐘。去除上清后,加入20mL蓋氏平衡鹽溶液,靜置5-10分鐘。加入磷酸鹽緩沖液后再次離心,轉(zhuǎn)數(shù)為3000rpm離心5分鐘,如果還有肉眼可見(jiàn)紅細(xì)胞,可重復(fù)一次紅細(xì)胞溶解步驟。離心后去除上清,用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞,重懸待用。取已去除紅細(xì)胞的檢測(cè)樣品與等體積的0.01Mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液混合后,混合液置于15mL離心管充分混勻。加入上述己連接活化好的免疫磁珠與樣品充分混勻,置于分子雜交儀上旋轉(zhuǎn)震蕩使免疫磁充分吸附血液樣本中的目的細(xì)胞。取出離心管置于磁力架上,在磁力的作用下棄去上清液,用0.01Mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液反復(fù)洗滌3次,用槍頭反復(fù)沖刷洗滌。重懸至澄清,最終得到50u1液體,涂片后普通顯微鏡下檢測(cè)免疫磁珠上是否有細(xì)胞吸附。3免疫熒光三重染色法鑒別三種目的細(xì)胞將重懸的細(xì)胞樣本均勻得鋪在玻片上,形成單層,待染色。待標(biāo)本涂片半干,在室溫下加入4%多聚甲醛溶液固定標(biāo)本。待標(biāo)本固定完成后,用0.01Mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液輕柔洗滌標(biāo)本三次,用吸水紙吸取多余液體,晾至半干。用0.1%Triton X-100溶液,于室溫下對(duì)標(biāo)本進(jìn)行透化10十分鐘。透化完成,用0.01Mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液輕柔洗滌標(biāo)本三次,用吸水紙吸取多余液體,晾至半干。用5%牛血清白蛋白對(duì)涂片進(jìn)行封閉,并置于37℃孵箱中孵育30分鐘。取出玻片,用吸水紙吸去剩余的液體。用0.01Mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液輕柔洗滌標(biāo)本三次,用吸水紙吸取多余液體,晾至半干。準(zhǔn)備濕盒,對(duì)待用抗體進(jìn)行稀釋。對(duì)玻片上待測(cè)區(qū)域進(jìn)行畫圈后,滴加100uL稀釋好的一抗待其鋪滿全片后,將涂片放在濕盒里孵育,置于冰箱中4℃過(guò)夜。次日取出濕盒放于37℃培養(yǎng)箱中復(fù)溫1小時(shí)。用0.01Mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液輕柔洗滌標(biāo)本三次后,用吸水紙吸取多余液體,晾至半干,準(zhǔn)備孵育二抗。此步驟及以后步驟皆避光操作。在暗室對(duì)二抗進(jìn)行稀釋,在避光條件下加入稀釋好的二抗100uL,待其鋪滿全片后,將玻片放回濕盒中,在37℃培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)。孵育完成后,取出玻片在避光的條件下用0.01Mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液輕柔洗滌標(biāo)本三次后,用吸水紙吸取多余液體,稍稍晾干。于玻片待測(cè)范圍滴加DAPI溶液進(jìn)行細(xì)胞核染色,待其覆蓋全片后,立即封片,注意避免產(chǎn)生氣泡影響觀察。在熒光顯微鏡下采集圖像。4、根據(jù)三種內(nèi)皮細(xì)胞獨(dú)特的細(xì)胞學(xué)表型進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)在熒光顯微鏡下采集圖像,對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行鑒別與計(jì)數(shù)。通過(guò)免疫磁珠在外周血標(biāo)本中成功捕捉目的細(xì)胞,經(jīng)過(guò)涂片和免疫熒光染色方法,根據(jù)三種內(nèi)皮細(xì)胞的不同細(xì)胞表型(cBMECs的細(xì)胞型為DAPI+/CD146+/S100B+, cECs的細(xì)胞型為DAPI+/CD146+/S100B-, EPCs的細(xì)胞型為DAPI+/CD146+/CD133+/S100B-)進(jìn)行三種細(xì)胞的鑒別和細(xì)胞計(jì)數(shù)。5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件中的獨(dú)立t檢驗(yàn)、單因素方差分析(one-way ANOVA)、相關(guān)性分析等方法,取P0.05時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、結(jié)果1、免疫磁珠吸附分離外周血中的目的細(xì)胞將免疫磁珠吸附的目的細(xì)胞涂片后,把涂片放在普通顯微鏡下可看到：涂片中散在分布著免疫磁珠,它們是體型微小、圓形的折光性強(qiáng)的顆粒。對(duì)視野進(jìn)行搜尋可見(jiàn)零星分布著明顯的細(xì)胞形態(tài)的物體,一個(gè)細(xì)胞上往往吸附了多粒免疫磁珠。2、分離的三種目的細(xì)胞的免疫熒光三重染色結(jié)果取陰性對(duì)照樣本進(jìn)行免疫磁珠吸附和免疫熒光三重染色,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在四種波長(zhǎng)的激發(fā)光下均未發(fā)現(xiàn)明顯細(xì)胞形態(tài)物體出現(xiàn)。對(duì)病例組樣本在熒光顯微鏡下切換各色濾光片,可見(jiàn)同一視野下同一位點(diǎn)有DAPI+/CD146+/S100B+的細(xì)胞,即為cBMECs細(xì)胞；DAPI+/CD146+/S100B-的細(xì)胞,即為cECs細(xì)胞；DAPI+/CD146+/CD133+/S100B-的細(xì)胞,即為EPCs細(xì)胞。3、艾滋腦病病人與陰性對(duì)照的外周血中目的細(xì)胞計(jì)數(shù)比較根據(jù)cBMECs細(xì)胞、cECs細(xì)胞及EPCs細(xì)胞經(jīng)過(guò)免疫熒光三重染色后在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)顏色的不同,分別計(jì)數(shù)這三種細(xì)胞在艾滋腦病病人外周血和健康對(duì)照組外周血中的含量進(jìn)行比較。艾滋腦病病人外周血cBMECs細(xì)胞計(jì)數(shù)高于健康對(duì)照組,用獨(dú)立t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.92,P0.05)；艾滋腦病病人外周血中cECs細(xì)胞(t=8.29, P0.05)、EPCs(t=5.48, P0.05)細(xì)胞計(jì)數(shù)亦然。4、腦膜炎病人與陰性對(duì)照外周血中的目的細(xì)胞計(jì)數(shù)比較對(duì)cBMECs細(xì)胞、cECs細(xì)胞及EPCs細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光三重染色,在熒光顯微鏡下根據(jù)熒光顏色的不同,分別計(jì)數(shù)這三種細(xì)胞在腦膜炎病人外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行比較。腦膜炎病人外周血中cBMECs計(jì)數(shù)高于陰性對(duì)照組,經(jīng)獨(dú)立t檢驗(yàn),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.18,P0.05)。腦膜炎病人外周血中cECs細(xì)胞(t=15.03, P0.05、EPCs(t=9.89, P0.05)細(xì)胞計(jì)數(shù)亦然。5、非感染性腦外傷病人與陰性對(duì)照外周血中的目的細(xì)胞計(jì)數(shù)比較對(duì)cBMECs細(xì)胞、cECs細(xì)胞及EPCs細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光三重染色,在熒光顯微鏡下根據(jù)熒光顏色的不同,分別計(jì)數(shù)這三種細(xì)胞在非感染性腦外傷病人外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行比較。非感染性腦外傷病人外周血中cBMECs計(jì)數(shù)高于陰性對(duì)照組,經(jīng)獨(dú)立t檢驗(yàn),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.02,P0.05)。非感染性腦外傷病人外周血中cECs細(xì)胞(t=8.75, P0.05)、EPCs(t= 5.16, P0.05)細(xì)胞計(jì)數(shù)亦然。6、艾滋腦病病人、腦膜炎病人與非感染性腦外傷病人外周血中的三種目的細(xì)胞計(jì)數(shù)比較對(duì)cBMECs細(xì)胞、cECs細(xì)胞及EPCs細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光三重染色,在熒光顯微鏡下根據(jù)熒光顏色的不同,分別計(jì)數(shù)這三種細(xì)胞在艾滋腦病、腦膜炎及非感染性腦外傷病人外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行比較。結(jié)果顯示,腦膜炎組和艾滋腦病組外周血中cBMECs計(jì)數(shù)高于非感染性腦外傷組,經(jīng)單因素方差分析檢驗(yàn),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.99,P0.05),后續(xù)兩兩比較結(jié)果為艾滋腦病組外周血cBMECs計(jì)數(shù)與腦膜炎組無(wú)顯著差異(P0.05)。腦膜炎病人外周血中cECs細(xì)胞(F=3.77, P0.05)、EPCs(F=28.76, P0.05)細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于其他兩組,后續(xù)兩兩比較結(jié)果顯示艾滋腦病組EPCs細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于非感染性腦外傷組(P0.05),但cECs細(xì)胞計(jì)數(shù)沒(méi)有顯著差異(P0.05)。7、艾滋腦病組血中HIV病毒載量與cBMECs含量的關(guān)系采集艾滋腦病患者血中HIV病毒載量信息與其對(duì)應(yīng)外周血cBMECs計(jì)數(shù)做相關(guān)性分析。以HIV病毒載量為縱坐標(biāo),cBMECs含量為橫坐標(biāo)做散點(diǎn)圖,可見(jiàn)cBMECs含量隨HIV病毒載量的增加而增加,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示此線性相關(guān)關(guān)系具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.93,P0.05)。8、腦膜炎組外周血cBMECs含量與腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的相關(guān)性分析采集腦膜炎病人的腦脊液檢查信息,以腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)與相應(yīng)外周血cBMECs計(jì)數(shù)做相關(guān)性分析。以腦膜炎病人腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)為縱坐標(biāo), cBMECs含量為橫坐標(biāo)做散點(diǎn)圖,可見(jiàn)腦膜炎病人腦脊液白細(xì)胞含量隨外周血cBMECs含量的增加而增加,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示此線性相關(guān)關(guān)系具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：r=0.91,P0.05。9、腦膜炎組外周血cBMECs含量與腦脊液總蛋白含量結(jié)果的相關(guān)性分析采集腦膜炎病人的腦脊液檢查信息,以腦脊液總蛋白含量與相應(yīng)外周血cBMECs計(jì)數(shù)做相關(guān)性分析。以腦膜炎病人腦脊液總蛋白含量為縱坐標(biāo),cBMECs含量為橫坐標(biāo)做散點(diǎn)圖,可見(jiàn)腦膜炎病人腦脊液總蛋白含量隨外周血cBMECs含量的增加而增加,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示此線性相關(guān)關(guān)系具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：對(duì)r=0.92,P0.05。四、結(jié)論1、本課題應(yīng)用免疫磁珠分離技術(shù)從外周血標(biāo)本中分離出內(nèi)皮細(xì)胞；2、建立了檢測(cè)人外周血中BBB損傷新型標(biāo)志物cBMECs的方法；3、病例組外周血中cBMECs計(jì)數(shù)顯著高于健康對(duì)照組,提示病例組存在BBB損傷,有BMECs變性、脫落。4、病例組外周血中cECs計(jì)數(shù)、EPCs計(jì)數(shù)均顯著高于健康對(duì)照組,提示病例組存在內(nèi)皮細(xì)胞受損,內(nèi)皮修復(fù)功能增強(qiáng)；5、艾滋腦病病例和腦膜炎病例外周血cBMECs計(jì)數(shù)顯著高于非感染性腦外傷組,驗(yàn)證外周血cBMECs計(jì)數(shù)反映BBB損傷程度,可以作為BBB損傷的外周血中的指示物。6、外周血cBMECs計(jì)數(shù)與艾滋腦病組血中HIV病毒載量、腦膜炎組腦脊液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)和總蛋白含量均呈正相關(guān)關(guān)系,驗(yàn)證了外周血cBMECs計(jì)數(shù)的確可以反應(yīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。
【關(guān)鍵詞】：血腦屏障損傷 生物標(biāo)志物 cBMECs 外周血 檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R741
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-24
• 第一章 外周血中BBB損傷新標(biāo)志物cBMECs檢測(cè)方法建立24-37
• 1.1 材料25-27
• 1.2 方法27-29
• 1.3 結(jié)果29-34
• 1.4 討論34-37
• 第二章 外周血中BBB損傷新型標(biāo)志物cBMECs檢測(cè)的臨床應(yīng)用37-54
• 2.1 材料37-40
• 2.2 方法40-42
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理42
• 2.4 結(jié)果42-49
• 2.5 討論49-54
• 全文總結(jié)54-59
• 參考文獻(xiàn)59-65
• 附錄65-68
• 英文縮略詞表68-69
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文69-70
• 致謝70-71

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

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  本文關(guān)鍵詞：外周血中血腦屏障損傷新型標(biāo)志物cBMECs檢測(cè)方法的建立和臨床應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：290277