本文關鍵詞：外周血中血腦屏障損傷新型標志物cBMECs檢測方法的建立和臨床應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：一、研究背景全球范圍內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病的致殘率一直居高不下,有調(diào)查顯示全世界有1/3的人將會有CNS損傷的可能,而且CNS損傷的概率隨年齡增加而增加。血腦屏障(BBB)是大腦中樞的天然保護傘,其形態(tài)、功能的微小改變皆能給病原入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)帶來可乘之機,BBB相關的疾病所致的住院率和預后時間延長均高于其他疾病。實驗研究發(fā)現(xiàn),BBB的損傷在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的發(fā)生過程中有關鍵作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病往往伴隨BBB結構和功能的劇烈變化。因此監(jiān)視、檢測BBB的形態(tài)、功能的細微變化可以預測中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染損傷,對臨床早期診斷、治療有重要意義,也成為診斷、治療、預防CNS損傷相關疾病的重要突破點。BBB損傷的定量檢測曾經(jīng)是CNS損傷檢測的難點所在。成功分離和培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細胞(BMECs,BBB的體外模型)使得BBB損傷的致病機制研究(感染及藥物所致)成為可能。過去幾十年間,學者們采用了許多體內(nèi)實驗方法檢測BBB的功能：循環(huán)血中的蛋白(如白蛋白)滲透進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的蛋白(如S100B)釋放入循環(huán)血等都用來檢測BBB損傷。雖然這些技術都利用了內(nèi)源性蛋白,但是BBB的破壞可能并非僅與某些特異性結果引起的蛋白水平改變相關。近來基于分子成像技術的MPI在神經(jīng)科學領域受到廣泛關注。雖然學者們在體外實驗中使用了許多合成造影劑,但是很少能在活體動物腦部得到穩(wěn)定結果。神經(jīng)影像技術的最大難題在于顯影劑很少能夠成功通過BBB。其他的技術包括注射染色,如依文思藍染色,注射進入動物模型來檢測BBB完整性。這些技術的共同缺憾在于它們都不能被無創(chuàng)地運用于人體。近年來的研究發(fā)現(xiàn),外周血中循環(huán)內(nèi)皮細胞(cECs)的多少可反映因心血管損傷和免疫疾病而引起的血管內(nèi)皮損傷程度,該技術因其新穎性和無創(chuàng)性備受關注。大多cECs定量程序都包括一道富集步驟：通過磁珠偶聯(lián)抗體進行免疫磁性分離。在外周血中循環(huán)的內(nèi)皮細胞中,一些是終極分化的細胞(cECs),另外一些是前體樣細胞(EPCs),EPCs可能參與誘導引導至靶位點的新血管形成。這些文獻更多的講述cECs在病理條件下被大量檢測到,cECs可以作為血管損傷性疾病或某些免疫相關疾病的標志物。由此我們得到啟發(fā),既然BBB主要由一種特殊的內(nèi)皮細胞(BMECs)組成,那么BBB受損后,脫落至循環(huán)中的BMECs,即cBMECs,可以看做是BBB損傷的生物標志物�；贐BB損傷和CNS的長期研究,我們假設cBMECs有成熟的BBB細胞型,在CNS的病理改變的腦微血管結構中動態(tài)脫落。外周血中的BMECs可以用實驗手段進行檢測,作為提示BBB損傷的生物標志物。二、研究方法1、磁珠活化與UEAI相偶聯(lián)吸附外周血內(nèi)皮細胞稱取粘附素UEA-I溶于0.5M pH9.5硼酸鹽緩沖液中,以0.2mg/ml比例震蕩至充分溶解。加入等體積的濃度為4×108/mL的免疫磁珠,充分混勻后,置于室溫充分地顛倒震蕩,搖動孵育24小時,使免疫磁珠Dynabeads M-450 Tosylactivated與磁珠包被物Ulex europaeus I (UEA I) lectin充分接觸,形成穩(wěn)定連接復合物。經(jīng)過孵育,將混合物置于磁力架上,在磁力作用下用0.01Mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液反復沖洗,棄去上清,借助磁力保留免疫磁珠,洗滌三到五次為宜。棄去上清后的磁珠用含0.1%胎牛血清的0.01Mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液重懸,放于4℃保存過夜。次日取出置于4℃的磁珠懸液,放在磁力架上棄去上清液體,用含有5%胎牛血清的Hanks緩沖液重懸磁珠至4×108/mL待用。2、免疫磁珠吸附外周血樣本中的目的細胞應用真空采血針采集肘正中靜脈血,采集2m1靜脈血加入EDTA抗凝管,并在采集后的24小時內(nèi)進行磁珠吸附。取2mL待測樣品外周血液與20mL含有5U肝素的磷酸鹽緩沖液與離心管中充分混合。將混合物放入離心機,以3000rpm的轉(zhuǎn)數(shù)充分離心5分鐘。去除上清后,加入20mL蓋氏平衡鹽溶液,靜置5-10分鐘。加入磷酸鹽緩沖液后再次離心,轉(zhuǎn)數(shù)為3000rpm離心5分鐘,如果還有肉眼可見紅細胞,可重復一次紅細胞溶解步驟。離心后去除上清,用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞,重懸待用。取已去除紅細胞的檢測樣品與等體積的0.01Mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液混合后,混合液置于15mL離心管充分混勻。加入上述己連接活化好的免疫磁珠與樣品充分混勻,置于分子雜交儀上旋轉(zhuǎn)震蕩使免疫磁充分吸附血液樣本中的目的細胞。取出離心管置于磁力架上,在磁力的作用下棄去上清液,用0.01Mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液反復洗滌3次,用槍頭反復沖刷洗滌。重懸至澄清,最終得到50u1液體,涂片后普通顯微鏡下檢測免疫磁珠上是否有細胞吸附。3免疫熒光三重染色法鑒別三種目的細胞將重懸的細胞樣本均勻得鋪在玻片上,形成單層,待染色。待標本涂片半干,在室溫下加入4%多聚甲醛溶液固定標本。待標本固定完成后,用0.01Mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液輕柔洗滌標本三次,用吸水紙吸取多余液體,晾至半干。用0.1%Triton X-100溶液,于室溫下對標本進行透化10十分鐘。透化完成,用0.01Mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液輕柔洗滌標本三次,用吸水紙吸取多余液體,晾至半干。用5%牛血清白蛋白對涂片進行封閉,并置于37℃孵箱中孵育30分鐘。取出玻片,用吸水紙吸去剩余的液體。用0.01Mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液輕柔洗滌標本三次,用吸水紙吸取多余液體,晾至半干。準備濕盒,對待用抗體進行稀釋。對玻片上待測區(qū)域進行畫圈后,滴加100uL稀釋好的一抗待其鋪滿全片后,將涂片放在濕盒里孵育,置于冰箱中4℃過夜。次日取出濕盒放于37℃培養(yǎng)箱中復溫1小時。用0.01Mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液輕柔洗滌標本三次后,用吸水紙吸取多余液體,晾至半干,準備孵育二抗。此步驟及以后步驟皆避光操作。在暗室對二抗進行稀釋,在避光條件下加入稀釋好的二抗100uL,待其鋪滿全片后,將玻片放回濕盒中,在37℃培養(yǎng)箱中孵育2小時。孵育完成后,取出玻片在避光的條件下用0.01Mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液輕柔洗滌標本三次后,用吸水紙吸取多余液體,稍稍晾干。于玻片待測范圍滴加DAPI溶液進行細胞核染色,待其覆蓋全片后,立即封片,注意避免產(chǎn)生氣泡影響觀察。在熒光顯微鏡下采集圖像。4、根據(jù)三種內(nèi)皮細胞獨特的細胞學表型進行細胞計數(shù)在熒光顯微鏡下采集圖像,對目的細胞進行鑒別與計數(shù)。通過免疫磁珠在外周血標本中成功捕捉目的細胞,經(jīng)過涂片和免疫熒光染色方法,根據(jù)三種內(nèi)皮細胞的不同細胞表型(cBMECs的細胞型為DAPI+/CD146+/S100B+, cECs的細胞型為DAPI+/CD146+/S100B-, EPCs的細胞型為DAPI+/CD146+/CD133+/S100B-)進行三種細胞的鑒別和細胞計數(shù)。5、統(tǒng)計學處理結果用均數(shù)±標準差(X±S)表示,統(tǒng)計方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件中的獨立t檢驗、單因素方差分析(one-way ANOVA)、相關性分析等方法,取P0.05時,差異有統(tǒng)計學意義。三、結果1、免疫磁珠吸附分離外周血中的目的細胞將免疫磁珠吸附的目的細胞涂片后,把涂片放在普通顯微鏡下可看到：涂片中散在分布著免疫磁珠,它們是體型微小、圓形的折光性強的顆粒。對視野進行搜尋可見零星分布著明顯的細胞形態(tài)的物體,一個細胞上往往吸附了多粒免疫磁珠。2、分離的三種目的細胞的免疫熒光三重染色結果取陰性對照樣本進行免疫磁珠吸附和免疫熒光三重染色,實驗結果顯示在四種波長的激發(fā)光下均未發(fā)現(xiàn)明顯細胞形態(tài)物體出現(xiàn)。對病例組樣本在熒光顯微鏡下切換各色濾光片,可見同一視野下同一位點有DAPI+/CD146+/S100B+的細胞,即為cBMECs細胞；DAPI+/CD146+/S100B-的細胞,即為cECs細胞；DAPI+/CD146+/CD133+/S100B-的細胞,即為EPCs細胞。3、艾滋腦病病人與陰性對照的外周血中目的細胞計數(shù)比較根據(jù)cBMECs細胞、cECs細胞及EPCs細胞經(jīng)過免疫熒光三重染色后在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)顏色的不同,分別計數(shù)這三種細胞在艾滋腦病病人外周血和健康對照組外周血中的含量進行比較。艾滋腦病病人外周血cBMECs細胞計數(shù)高于健康對照組,用獨立t檢驗進行統(tǒng)計分析,差異具有統(tǒng)計學意義(t=4.92,P0.05)；艾滋腦病病人外周血中cECs細胞(t=8.29, P0.05)、EPCs(t=5.48, P0.05)細胞計數(shù)亦然。4、腦膜炎病人與陰性對照外周血中的目的細胞計數(shù)比較對cBMECs細胞、cECs細胞及EPCs細胞進行免疫熒光三重染色,在熒光顯微鏡下根據(jù)熒光顏色的不同,分別計數(shù)這三種細胞在腦膜炎病人外周血細胞計數(shù)進行比較。腦膜炎病人外周血中cBMECs計數(shù)高于陰性對照組,經(jīng)獨立t檢驗,差別有統(tǒng)計學意義(t=11.18,P0.05)。腦膜炎病人外周血中cECs細胞(t=15.03, P0.05、EPCs(t=9.89, P0.05)細胞計數(shù)亦然。5、非感染性腦外傷病人與陰性對照外周血中的目的細胞計數(shù)比較對cBMECs細胞、cECs細胞及EPCs細胞進行免疫熒光三重染色,在熒光顯微鏡下根據(jù)熒光顏色的不同,分別計數(shù)這三種細胞在非感染性腦外傷病人外周血細胞計數(shù)進行比較。非感染性腦外傷病人外周血中cBMECs計數(shù)高于陰性對照組,經(jīng)獨立t檢驗,差別有統(tǒng)計學意義(t=4.02,P0.05)。非感染性腦外傷病人外周血中cECs細胞(t=8.75, P0.05)、EPCs(t= 5.16, P0.05)細胞計數(shù)亦然。6、艾滋腦病病人、腦膜炎病人與非感染性腦外傷病人外周血中的三種目的細胞計數(shù)比較對cBMECs細胞、cECs細胞及EPCs細胞進行免疫熒光三重染色,在熒光顯微鏡下根據(jù)熒光顏色的不同,分別計數(shù)這三種細胞在艾滋腦病、腦膜炎及非感染性腦外傷病人外周血細胞計數(shù)進行比較。結果顯示,腦膜炎組和艾滋腦病組外周血中cBMECs計數(shù)高于非感染性腦外傷組,經(jīng)單因素方差分析檢驗,差別有統(tǒng)計學意義(F=6.99,P0.05),后續(xù)兩兩比較結果為艾滋腦病組外周血cBMECs計數(shù)與腦膜炎組無顯著差異(P0.05)。腦膜炎病人外周血中cECs細胞(F=3.77, P0.05)、EPCs(F=28.76, P0.05)細胞計數(shù)顯著高于其他兩組,后續(xù)兩兩比較結果顯示艾滋腦病組EPCs細胞計數(shù)顯著高于非感染性腦外傷組(P0.05),但cECs細胞計數(shù)沒有顯著差異(P0.05)。7、艾滋腦病組血中HIV病毒載量與cBMECs含量的關系采集艾滋腦病患者血中HIV病毒載量信息與其對應外周血cBMECs計數(shù)做相關性分析。以HIV病毒載量為縱坐標,cBMECs含量為橫坐標做散點圖,可見cBMECs含量隨HIV病毒載量的增加而增加,統(tǒng)計結果顯示此線性相關關系具有統(tǒng)計學意義(r=0.93,P0.05)。8、腦膜炎組外周血cBMECs含量與腦脊液白細胞計數(shù)結果的相關性分析采集腦膜炎病人的腦脊液檢查信息,以腦脊液白細胞計數(shù)與相應外周血cBMECs計數(shù)做相關性分析。以腦膜炎病人腦脊液白細胞計數(shù)為縱坐標, cBMECs含量為橫坐標做散點圖,可見腦膜炎病人腦脊液白細胞含量隨外周血cBMECs含量的增加而增加,統(tǒng)計結果顯示此線性相關關系具有統(tǒng)計學意義：r=0.91,P0.05。9、腦膜炎組外周血cBMECs含量與腦脊液總蛋白含量結果的相關性分析采集腦膜炎病人的腦脊液檢查信息,以腦脊液總蛋白含量與相應外周血cBMECs計數(shù)做相關性分析。以腦膜炎病人腦脊液總蛋白含量為縱坐標,cBMECs含量為橫坐標做散點圖,可見腦膜炎病人腦脊液總蛋白含量隨外周血cBMECs含量的增加而增加,統(tǒng)計結果顯示此線性相關關系具有統(tǒng)計學意義：對r=0.92,P0.05。四、結論1、本課題應用免疫磁珠分離技術從外周血標本中分離出內(nèi)皮細胞；2、建立了檢測人外周血中BBB損傷新型標志物cBMECs的方法；3、病例組外周血中cBMECs計數(shù)顯著高于健康對照組,提示病例組存在BBB損傷,有BMECs變性、脫落。4、病例組外周血中cECs計數(shù)、EPCs計數(shù)均顯著高于健康對照組,提示病例組存在內(nèi)皮細胞受損,內(nèi)皮修復功能增強；5、艾滋腦病病例和腦膜炎病例外周血cBMECs計數(shù)顯著高于非感染性腦外傷組,驗證外周血cBMECs計數(shù)反映BBB損傷程度,可以作為BBB損傷的外周血中的指示物。6、外周血cBMECs計數(shù)與艾滋腦病組血中HIV病毒載量、腦膜炎組腦脊液中白細胞計數(shù)和總蛋白含量均呈正相關關系,驗證了外周血cBMECs計數(shù)的確可以反應中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。
【關鍵詞】：血腦屏障損傷 生物標志物 cBMECs 外周血 檢測
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R741
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-24
• 第一章 外周血中BBB損傷新標志物cBMECs檢測方法建立24-37
• 1.1 材料25-27
• 1.2 方法27-29
• 1.3 結果29-34
• 1.4 討論34-37
• 第二章 外周血中BBB損傷新型標志物cBMECs檢測的臨床應用37-54
• 2.1 材料37-40
• 2.2 方法40-42
• 2.3 統(tǒng)計學處理42
• 2.4 結果42-49
• 2.5 討論49-54
• 全文總結54-59
• 參考文獻59-65
• 附錄65-68
• 英文縮略詞表68-69
• 攻讀學位期間發(fā)表論文69-70
• 致謝70-71

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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  本文關鍵詞：外周血中血腦屏障損傷新型標志物cBMECs檢測方法的建立和臨床應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：290277