目的:本研究目的在于定位一個就診于蘭大二院癲癇中心的良性家族性嬰兒癲癇家系的致病基因,通過對臨床表型及生物樣本的提取,應(yīng)用連鎖分析、全外顯子測序的方法,發(fā)現(xiàn)家系的致病基因及遺傳多態(tài)性,從而定位該家系的致病基因,提示病理生理分子機(jī)制,為基因組治療和新藥的開發(fā)提供理論依據(jù),提高治療的靶向性。方法:本課題收集了1個良性家族性嬰兒癲癇家系,家系成員共12人,其中,患者5人,非患者7人。對上述家系成員分別采外周血5 ml,提取gDNA,基于常見551個癲癇致病基因的癲癇基因包結(jié)果進(jìn)行初步篩選,篩選出2個基因,PRRT2基因和RHAG基因,再次進(jìn)行一代測序驗證,引物序列來自NCBI,PCR反應(yīng)總體積50 ul。擴(kuò)增結(jié)果的大小應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳來判斷。連鎖分析采用LINKAGE軟件,在常染色體顯性遺傳模式下,根據(jù)LOD值判斷是否連鎖。應(yīng)用Agilent的液相芯片捕獲系統(tǒng),對全外顯子區(qū)域DNA進(jìn)行富集,然后在Illumina HiSeq2500/4000測序平臺上進(jìn)行高通量測序。再應(yīng)用dbSNP數(shù)據(jù)庫、1000dGenome數(shù)據(jù)庫、SIFT和PolyPhen2軟件進(jìn)行基因的篩選。結(jié)果:PRRT2基因及RHAG基因的Sanger測序結(jié)果不符合孟德爾遺傳定律,家系連鎖分析結(jié)果LOD值在1-1.5之間,全外顯子測序結(jié)果篩出29個候選基因。結(jié)論:PRRT2基因不是該BFIE家系的致病基因;RHAG基因不是良性家族性嬰兒癲癇的致病基因;家系連鎖分析未標(biāo)記出LOD值大于3的染色體區(qū)域。全外顯子測序結(jié)果篩出29個候選基因。
【學(xué)位單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R742.1
【部分圖文】：

即所觀察到的連鎖不是偶然發(fā)生的）。使用軟件 merlin（v1.1.2）對 LOD值較高的區(qū)域進(jìn)行單倍型分析，使用軟件 HaploPainter 進(jìn)行單倍型圖形的繪制。2.2.10 全外顯子測序：原理：外顯子測序（exome sequencing）是指利用特定的探針對蛋白編碼區(qū)域內(nèi)的 DNA 或某段特定序列進(jìn)行富集，隨后通過高通量測序技術(shù)（"Next-generation" sequencing technology）對該目標(biāo)區(qū)域測序，從而發(fā)現(xiàn)特定遺傳信息，該技術(shù)可用于研究孟德爾疾病致病基因和易感基因。本研究應(yīng)用 IlluminaHiseq 2000 高通量測序技術(shù)對 4 名家系成員（II7、II9、III5、IV1）進(jìn)行分別測序。實驗流程：（1）樣本檢測：DNA 樣本要求>1.5ug(Qubit 定量值)，瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢合格。DNA 純度（OD260/280=1.8~2.0）。（2）構(gòu)建文庫：基因組 DNA 被隨機(jī)打斷成片段（大小為 150-300bp 之間），通過末端修復(fù)、加 polyA 尾制備 DNA 文庫。

蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 一個良性家族性基因的突變分析表 3-1 PRRT2 基因RT2（NM_001256442）苷酸變化 氨基酸變化 變異類型 家父親 640_641insC p.Arg217ProfsTer8 雜合 未發(fā)現(xiàn)變異個家系進(jìn)行 PRRT2 基因的一代測序驗證：

父親 母親c.640_641insC p.Arg217ProfsTer8 雜合 未發(fā)現(xiàn)變異雜合整個家系進(jìn)行 PRRT2 基因的一代測序驗證：圖 3-5 II2 驗證結(jié)果未發(fā)現(xiàn)變異
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本文編號：2891548