膠質(zhì)瘤是臨床上最為常見的原發(fā)性腦腫瘤,患者的生存中期僅為12到14個(gè)月,5年生存率低于5%。膠質(zhì)瘤中一小部分具有干性的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞是手術(shù)治療后復(fù)發(fā)以及形成耐藥的主要原因,至今依舊沒有特效藥物可以徹底治療膠質(zhì)瘤。在本研究中,我們通過帶有Nestin-GFP報(bào)告基因的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系高通量篩選天然產(chǎn)物化合物庫從中發(fā)現(xiàn)了葫蘆素D。葫蘆素D可以劑量依賴性地抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞(A172,U87-MG,U251)的活性和生長,其對(duì)應(yīng)IC50值分別為700nM,150nM,200nM。進(jìn)一步的研究表明葫蘆素D通過抑制金屬蛋白酶(MMP)降低了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。經(jīng)過流式細(xì)胞分析得知,葫蘆素D處理的細(xì)胞被阻滯在G2/M期,細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki-67表達(dá)減少,DNA合成受到抑制,這些則是由葫蘆素D誘導(dǎo)的P53表達(dá)增強(qiáng)和ERK磷酸化減少(失活)導(dǎo)致的。與此同時(shí)葫蘆素D能破壞線粒體功能導(dǎo)致呼吸鏈?zhǔn)軗p、活性氧水平上升從而誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡,表現(xiàn)為Annexin V陽性細(xì)胞的顯著增加。在與膠質(zhì)瘤治療一線藥物替莫唑胺聯(lián)用時(shí)葫蘆素D顯示出較強(qiáng)的協(xié)同作用。進(jìn)一步的分子機(jī)理研究顯示:STAT3,AKT1磷酸化激活被抑制,因此導(dǎo)致下游干性相關(guān)基因Sox2,Oct3/4,htert以及膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133,Nestin,Olig2等的表達(dá)下調(diào),而膠質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)志物Gfap,Mbp的表達(dá)上升。在腫瘤異種移植實(shí)驗(yàn)中,葫蘆素D有效抑制了異種移植膠質(zhì)瘤的生長,且表現(xiàn)為極低的生理毒性。綜上所述,我們首次發(fā)現(xiàn)了葫蘆素D作為潛在的抗膠質(zhì)瘤藥物或膠質(zhì)瘤治療輔助藥物具有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值,值得進(jìn)一步深入研究。
【學(xué)位單位】：杭州師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.4
【部分圖文】：

18圖 1 葫蘆素 D 抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長：（A）三種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 A172，U87，U251 在不同葫蘆度 D 濃度下處理 24 小時(shí)后的細(xì)胞形態(tài)變化。（B）葫蘆素 D 化學(xué)結(jié)構(gòu)式。（C）葫蘆素 D 劑量依賴性抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長。（D）不同濃度葫蘆素 D 處理下膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長曲線。（E,F）不同濃度葫蘆素 D 處理下培養(yǎng) 21 天后，處理組較對(duì)照組集落形成數(shù)目大大減少（F）是對(duì)集落數(shù)目的統(tǒng)計(jì)。重復(fù)試驗(yàn)一式三份且結(jié)果一致，P 值已在圖中顯示。襲對(duì) GBM 的轉(zhuǎn)移很重要，經(jīng)葫蘆素 D 處理的細(xì)胞比對(duì)照組穿過鋪有基質(zhì)膠的基底膜的數(shù)量有所減少（從大約 300 到 150）（圖 2D），證實(shí)了葫蘆素 D 降低了細(xì)胞的機(jī)動(dòng)活性和生存活性。在以往研究中報(bào)道過基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）在多種癌癥的轉(zhuǎn)移中起到重要作用，MMP 可通過細(xì)胞外基質(zhì)的分解直接促進(jìn)細(xì)胞遷

19圖 2 葫蘆度 D 抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲:（A,B）劃痕后在有葫蘆素 D 存在的情況下愈合速度變慢（B）是對(duì)平均遷移距離的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。（C,D）在有葫蘆素 D 存在的情況下，穿過 Transwell 基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)目明顯變少，（D）是對(duì)穿過細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)。（E,F）在有葫蘆素 D 的情況下，膠質(zhì)瘤單細(xì)胞遷移速度明顯減小，（F）是對(duì)遷移速度的量化統(tǒng)計(jì)。（G,H）經(jīng)葫蘆素 D 處理后，MMP1 表達(dá)量降低。（H）是對(duì) WB 結(jié)果的量化。重復(fù)試驗(yàn)一式三份且結(jié)果一致，P 值已在圖中顯示。4.4 葫蘆素 D 通過阻礙 G2/M 期抑制細(xì)胞增殖前面的結(jié)果顯示，葫蘆素 D 劑量依賴性抑制 GBM 細(xì)胞的增殖。為了揭示其

我們采用了 PI 染色實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞周期來研究葫蘆素 D 對(duì) GBM 細(xì)胞周期控制的影響（圖 3.1A）。與對(duì)照組相比，處理組導(dǎo)致 GBM 在 G2/M 期的細(xì)胞比例增加（圖3.1B）。細(xì)胞周期停滯在G2/M期使得進(jìn)入G1或G0期的細(xì)胞減少，這種結(jié)果可致使受損的 GBM 細(xì)胞增強(qiáng)凋亡，從而增加化療的細(xì)胞毒性。進(jìn)一步WB 結(jié)果表明葫蘆素 D 通過增強(qiáng) P53 表達(dá)，阻止 Erk 磷酸化來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和增殖（圖 3.2F）。同樣的，Ki-67 蛋白的細(xì)胞含量與細(xì)胞周期進(jìn)展、腫瘤惡性程度密切相關(guān)，葫蘆素 D 處理后 Ki-67 陽性細(xì)胞比例降低（圖 3.2B）。BrdU 結(jié)果也顯示隨葫蘆素 D 濃度的升高而降低，表明細(xì)胞 DNA 的合成與復(fù)制受到抑制（圖3.2D）。圖 3.1 葫蘆素 D 阻礙膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期：隨著葫蘆素 D 濃度升高，細(xì)胞 G2/M 期細(xì)胞所占比例逐漸增多（A）
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