目的:探究腦缺糖缺氧后CD99能否介導(dǎo)中性粒細(xì)胞穿越腦血管內(nèi)皮進(jìn)而參與腦損傷炎性機(jī)制過程。方法:采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法,將鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞(bEnd.3細(xì)胞系)在混合有基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle Medium,DMEM)+ 10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)+1%雙抗(Pen Strep,PS)的培養(yǎng)液中培養(yǎng),并在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。采用密度梯度離心法從小鼠骨髓提取中性粒細(xì)胞:麻醉處死小鼠,無菌剝離下肢皮膚、肌肉,并提取下肢骨骨髓,使用低滲氯化鈉溶液(0.2%NaCl)裂解紅細(xì)胞,然后用高滲氯化鈉溶液(1.6%NaCl)平衡滲透壓。隨后將提取的白細(xì)胞用 PBS 懸浮,并用 Histopaque-1119(密度,1.119g/ml),Histopaque-1077(密度,1.077 g/ml)進(jìn)行密度梯度離心,兩種離心液之間即為中性粒細(xì)胞。對(duì)提取的中性粒細(xì)胞使用瑞氏-吉姆薩染色進(jìn)行染色確認(rèn)。CD99在內(nèi)皮細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞上的表達(dá)使用免疫熒光染色的方法檢測(cè)(內(nèi)皮細(xì)胞在爬片上培養(yǎng)2天,中性粒細(xì)胞均勻鋪在載玻片上,自然風(fēng)干),依次孵育一抗二抗并用顯微鏡觀察。用 Western Blot 方法檢測(cè)對(duì)照組、氧糖剝奪(Oxygen Glucose Deprivation,OGD)組、白細(xì)胞介素-1(Interleukin-1,IL-1β)組、OGD+IL-1β組CD99、細(xì)胞間粘附分子-1(Intercellular-adhesion molecule,ICAM-1)、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(platelet-endothelial cell adhesion mol ecule,PEC AM-1,CD31)蛋白表達(dá)量。將bEnd.3細(xì)胞系種在6孔板內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),每組3孔,OGD時(shí)間3.5小時(shí),IL-1β濃度10ng/ml,持續(xù)16小時(shí),OGD+IL-1β組為IL-1β處理16h后進(jìn)行OGD處理,處理結(jié)束提取蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。Western Blot操作不同時(shí)間重復(fù)3次。低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)與 CD99 的關(guān)系研究,同樣采用WesternBlot檢測(cè),將6孔板內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞分為常氧組與OGD組,每組按0μM,25μM,50μM 3種不同濃度給予HIF-1α抑制劑PX478,各濃度各有3孔。然后分別置于常氧或OGD條件下。最后提取蛋白進(jìn)行western blot檢測(cè)。在中性粒細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中,將內(nèi)皮細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng),待細(xì)胞80%聚集后,給予對(duì)照、OGD、OGD+抗-CD99、抗-CD99處理,CD99抗體濃度25μg/ml,孵育時(shí)間30分鐘。處理結(jié)束后加入中性粒細(xì)胞。顯微鏡下連續(xù)拍攝,計(jì)數(shù)穿過鼠腦血管內(nèi)皮的中性粒細(xì)胞,每組至少重復(fù)3次,使用Image J1.46r軟件計(jì)數(shù)穿過內(nèi)皮細(xì)胞的中性粒細(xì)胞,并與粘附的細(xì)胞數(shù)相比進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。使用GraphPadPrism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)值用均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析比較,組間比較用Newman-Keuls事后檢驗(yàn)。組間差異用p值表示*p0.05,**p0.01。結(jié)果:bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞均可表達(dá)CD99,并且在bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)均勻,不僅是表達(dá)在細(xì)胞連接位置;OGD后內(nèi)皮細(xì)胞CD99、ICAM-1、PECAM-1表達(dá)均升高(對(duì)照組對(duì)OGD組p0.05),IL-1β處理后ICAM-1升高(對(duì)照組對(duì) IL-1β組 p0.01),CD99 表達(dá)下降(OGD 組對(duì) OGD+IL-1 β 組 p0.01),PECAM-1無改變。OGD后干擾HIF-1α的表達(dá)不影響CD99的表達(dá);OGD組與對(duì)照組、OGD+抗-CD99組相比,穿過血管內(nèi)皮的中性粒細(xì)胞數(shù)明顯增多(對(duì)照組對(duì) OGD 組 p0.01,OGD 組對(duì) OGD+抗CD99 組 p0.01)。結(jié)論:氧糖剝奪后,腦血管內(nèi)皮細(xì)胞CD99表達(dá)升高,并且這種升高不依賴于HIF-1α,CD99具有介導(dǎo)外周中性粒細(xì)胞穿越腦血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而參與缺血性腦損傷的炎性過程的作用。
【學(xué)位單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R743.3
【文章目錄】：
縮略詞表
摘要
Abstract
第一章 緒論
    參考文獻(xiàn)
第二章 氧糖剝奪后CD99介導(dǎo)中性粒細(xì)胞穿過腦血管內(nèi)皮參與缺血性腦損傷炎性機(jī)制的研究
    引言
    材料與方法
        內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及中性粒細(xì)胞提取
        瑞氏-吉姆薩染色
        免疫熒光
        Western Blot
        中性粒細(xì)胞遷移比較
        統(tǒng)計(jì)分析
    結(jié)果
        內(nèi)皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞CD99表達(dá)
        IL-1β和OGD對(duì)CD99表達(dá)的影響
        OGD之后HIF-1α不介導(dǎo)CD99表達(dá)升高
        CD99介導(dǎo)OGD后中性粒細(xì)胞穿過鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞
    討論
    結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第三章 缺血性腦卒中炎性機(jī)制（綜述）
    引言
    血流中斷
    細(xì)胞損傷后免疫炎癥反應(yīng)
        危險(xiǎn)相關(guān)模式分子（Danger associated molecular pattern molecules,DAMPs）
        免疫細(xì)胞激活與炎癥因子釋放
        細(xì)胞因子與缺血損傷
        中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)與缺血性腦損傷
    總結(jié)
    參考文獻(xiàn)
致謝
附錄一 大動(dòng)脈粥樣硬化性和小動(dòng)脈閉塞性小卒中患者的早期神經(jīng)功能惡化的比較
    引言
    對(duì)象和方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
附錄二 碩士期間科研成果
    期刊文章
    參與課題
    碩士期間所獲獎(jiǎng)勵(lì)

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