糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥,其發(fā)病機制尚不明確,目前尚沒有有效的治療措施。因此,探討DPN的精確的發(fā)病機制為緩解患者病痛,具有重要意義。目前認為,造成DPN的主要原因是高血糖直接作用于脊神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元并造成神經(jīng)元的退變。高糖毒性刺激能激動多種信號通路,如PERK通路及其介導的細胞凋亡、氧化應激及內質網(wǎng)應激,并進一步激發(fā)一系列細胞因子與趨化因子的產(chǎn)生。細胞因子和趨化因子會加重細胞氧化應激與氮化應激,并促進神經(jīng)元細胞凋亡。本課題所研究的蛋白激酶Piml屬于絲/蘇氨酸激酶,其在細胞內處于持續(xù)激活狀態(tài),它不需要上游激酶的磷酸化,因此Piml激酶的活性直接與其表達水平相關,并且受轉錄與翻譯水平的調節(jié)。雖然蛋白激酶Piml在其他領域已有研究報道,但是本研究探討Piml在DPN引起的氧化應激、內質網(wǎng)應激及其誘導的凋亡和糖尿病神經(jīng)病理性疼痛中的新作用,并且探討Piml與PERK-ATF4-CHOP信號通路的新的相互關系。本課題利用鏈脲霉素(streptozotocin,STZ)誘導糖尿病小鼠模型來檢測Piml表達變化,發(fā)現(xiàn)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛小鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元Piml激酶的表達明顯升高。為了驗證Piml是否是DRG神經(jīng)元存活的重要分子,本研究利用體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元,使用免疫熒光檢測Piml在DRG神經(jīng)元中的表達與定位,結果顯示,Pim1不僅在DRG神經(jīng)元中有表達,而且與DRG神經(jīng)元亞型降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)陽性和神經(jīng)絲蛋白-200(neurofilament200,NF 200)陽性神經(jīng)元共定位。隨后發(fā)現(xiàn),Pim1蛋白水平表達自高糖處理12h起升高顯著,故假設Pim1的上調是神經(jīng)元對高糖損傷的保護反應。基于以上研究,本研究利用Pim1抑制劑TCS抑制其活性后研究Pim1對DRG神經(jīng)元細胞存活的作用:經(jīng)CCK8檢測神經(jīng)元細胞的存活率降低、TUNEL染色表明其細胞凋亡顯著增強;Western blot技術檢測顯示pBad以及抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl的表達水平顯著下調。這些研究結果表明,抑制蛋白激酶Pim1活性,DRG神經(jīng)元經(jīng)高糖刺激后更容易受到傷害。為了進一步驗證Pim1是否為DRG神經(jīng)元細胞存活的保護因素,Pim1能否抑制高糖引起的氧化應激、內質網(wǎng)應激及細胞凋亡,本研究利用DRG神經(jīng)元Pim1抑制劑TCS抑制Pim1激酶活性來探究高糖毒性對神經(jīng)元氧化應激的作用。結果顯示,高糖毒性作用使神經(jīng)元細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平明顯升高。信號通路分子PERK、CHOP以及ATF4的蛋白表達在高糖處理后雖有上調趨勢,但給予TCS后,均顯著上調,這表明抑制了 Pim1的活性可能通過該通路加重了內質網(wǎng)應激。通過以上結果發(fā)現(xiàn),雖然高糖條件下,DRG神經(jīng)元內ROS水平以及細胞凋亡并沒有顯著增加,可能是與Pim1激酶水平上調有關,但是在使用TCS抑制Pim1活性后,細胞凋亡及ROS顯著增加,表明抑制Pim1激酶的活性后敏化了 DRG神經(jīng)元對高糖損傷的反應。這些研究結果為以Pim1激酶為靶點的治療策略的制定提供了新的實驗依據(jù)。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R587.2;R747.9
【部分圖文】：

２?ＤＰＮ小鼠ＤＲＧ組織Ｐｉｍｌ蛋白水平變化??腹膜腔注射ＳＴＺ?８?ｗ后，取小鼠Ｌ４－５?ＤＲＧ，檢測Ｐｉｍｌ蛋白的表達水平變??化。糖尿病組小鼠ＤＲＧ組織Ｐｉｍｌ蛋白表達水平為對照組的１．９０±０．１８倍（圖２）。??這表明小鼠體內高血糖持續(xù)刺激一定的時間，Ｐｉｍｌ蛋白的表達水平上調與ＤＰＮ??的發(fā)生具有一定的關系，但這究竟是一種反應性保護性改變，還是有害的刺激性??改變尚有待于進一步探討。??２２??

圖３蛋白激酶Ｐｉｍｌ在ＤＲＧ神經(jīng)元及其不同亞群的表達。Ｐｉｍｌ與ＣＧＲＰ（＋）和ＮＦ２００（＋）??神經(jīng)元亞型共定位。??４高糖刺激下體外培養(yǎng)的ＤＲＧ神經(jīng)元Ｐｉｍｌ的表達水平變化??培養(yǎng)的ＤＲＧ神經(jīng)元在高糖刺激之前（０?ｈ）以及經(jīng)高糖處理６?ｈ、１２?ｈ、２４?ｈ、??４８?ｈ、７２?ｈ、９６?ｈ和１２０?ｈ多個時間點之后，用Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ實驗檢測Ｐｉｍｌ激酶??在ＤＲＧ神經(jīng)元的表達變化。結果顯示，高糖刺激１２?ｈ，Ｐｉｍｌ蛋白表達就出現(xiàn)顯??著上調，而且一直持續(xù)到１２０?ｈ，其中４８?ｈ？７２?ｈ維持在最高水平（圖４）。???ＨＧ???＾?＾?＾?＾??Ｐｉｍｌ?ｍａｍ?ｍｔｍ??－

４８?ｈ、７２?ｈ、９６?ｈ和１２０?ｈ多個時間點之后，用Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ實驗檢測Ｐｉｍｌ激酶??在ＤＲＧ神經(jīng)元的表達變化。結果顯示，高糖刺激１２?ｈ，Ｐｉｍｌ蛋白表達就出現(xiàn)顯??著上調，而且一直持續(xù)到１２０?ｈ，其中４８?ｈ？７２?ｈ維持在最高水平（圖４）。???ＨＧ???＾?＾?＾?＾??Ｐｉｍｌ?ｍａｍ?ｍｔｍ??ｐ－ａｃｔｉｎ?ｗ?ｗ?ｗ??圖４高糖刺激下，不同時間點ＤＲＧ神經(jīng)元Ｐｉｍｌ蛋白水平變化。??２４??
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本文編號：2886178