惡性膠質(zhì)瘤是成人腦部腫瘤中最常見的類型,約占顱腦腫瘤的40-50%,因為其浸潤性而難以通過傳統(tǒng)的手術(shù)切除,并以其極低的生存率為特征。而人類巨細胞病毒(HCMV)目前在膠質(zhì)瘤中所發(fā)揮的作用引起了相當大的興趣和爭議。程序性死亡因子1(PD-1)的單克隆抗體在膠質(zhì)瘤的治療過程中取得了一定的進展,但治療結(jié)果仍不盡如人意,其程序性死亡因子配體1(PD-L1,CD274),被認為和惡性膠質(zhì)瘤的免疫逃逸機制有關(guān),并與HCMV的感染具有相關(guān)性,而Toll樣受體3(TLR3)在病原體感染的細胞或動物中可以誘導抗病毒的狀態(tài),通過對TLR3和膠質(zhì)瘤中PD-L1表達變化關(guān)系的研究,我們希望探究新的聯(lián)合免疫治療方法,為臨床治療提供新的思路。目的:研究在HCMV感染的膠質(zhì)瘤中,PD-L1的表達機制是否與TLR3相關(guān)。方法:使用免疫組織化學染色技術(shù)檢測臨床膠質(zhì)瘤標本中IE2、PD-L1和TLR3的表達情況;HCMV感染膠質(zhì)瘤細胞后,使用q-PCR技術(shù)和免疫熒光染色技術(shù)檢測PD-L1 RNA和蛋白的表達情況;細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)封閉TLR3的表達;使用WB技術(shù)檢測封閉TLR3表達的膠質(zhì)瘤在感染HCMV后PD-L1的表達情況;使用ELISA技術(shù)檢測封閉TLR3表達的膠質(zhì)瘤感染HCMV后細胞因子TGF-β和IL-8的分泌情況。結(jié)果:我們在70%的Ⅲ級和85%的Ⅳ惡性膠質(zhì)瘤標本中發(fā)現(xiàn)IE2陽性,與IE2陰性的標本相比較,PD-L1和TLR3的表達量均呈現(xiàn)增高,P0.05;在HCMV感染膠質(zhì)瘤后0、6和72h提取RNA,0、24和72h提取蛋白質(zhì),檢測PD-L1的RNA和蛋白表達量升高20倍以上;轉(zhuǎn)染siRNA后,TLR3的表達量通過WB檢測下降70%以上,認為封閉成功;封閉TLR3后,感染HCMV后,PD-L1的表達量相較于未封閉組下降明顯,具有統(tǒng)計學意義,P0.05;封閉TLR3后,會誘導T細胞TGF-β的分泌,上升2倍以上,但抑制IL-8的分泌,幾乎無法檢測。結(jié)論:HCMV感染的膠質(zhì)瘤細胞中PD-L1的表達量相較于未感染組更高,這可能是HCMV促進膠質(zhì)瘤惡性程度升高的原因之一。而在封閉TLR3的表達后,在HCMV感染的腫瘤細胞中可以觀察到PD-L1的表達下降,我們認為PD-L1的表達可以由膠質(zhì)瘤細胞中的TLR3觸發(fā)介導,因此,我們提出了使用組合PD-L1單克隆抗體與阻斷TLR3觸發(fā)來針對HCMV感染的膠質(zhì)母細胞瘤的新型免疫治療。
【學位單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R739.4
【文章目錄】：
摘要
abstract
引言
實驗材料和試劑
    1.病理樣本和細胞病毒
    2.主要實驗儀器和設(shè)備
    3.主要實驗試劑來源及配制方法
        3.1 主要實驗試劑來源
        3.2 主要實驗試劑配制方法
實驗方法
    1.臨床標本組織化學染色
    2.膠質(zhì)瘤細胞感染HCMV
        2.1 細胞復(fù)蘇
        2.2 細胞的傳代
        2.3 細胞的凍存
        2.4 HCMV AD169 毒株的制備
        2.5 HCMV病毒的滴度的測定
        2.6 HCMV感染U87、原代膠質(zhì)瘤和星形膠質(zhì)細胞后RNA提取
        2.7 RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA
        2.8 熒光實時定量PCR分析HCMV感染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞后PD-L1 的表達
    3.免疫熒光技術(shù)檢測細胞感染HCMV后 PD-L1 的表達變化
        3.1 細胞感染HCMV處理
    4.siRNA轉(zhuǎn)染細胞封閉TLR3 表達
        4.1 小干擾RNA的構(gòu)建
        4.2 細胞轉(zhuǎn)染siRNA
    5.HCMV感染TLR3 封閉的膠質(zhì)瘤細胞后PD-L1 的表達情況
    6.共培養(yǎng)檢測細胞因子
    7.統(tǒng)計學分析
結(jié)果分析
    1.臨床標本組化染色分析
    2.細胞感染HCMV后 PD-L1的mRNA和蛋白表達變化
    3.封閉TLR3 表達及封閉后HCMV感染細胞PD-L1 的表達變化
    4.封閉TLR3 后誘導TGF-β分泌并抑制IL-8 分泌
討論
參考文獻
綜述
    1.1 人巨細胞病毒
    1.2 膠質(zhì)瘤與HCMV的關(guān)系
    1.3 PDL1 參與免疫逃逸
    1.4 HCMV感染后Toll樣受體的變化
    1.5 TLR3 觸發(fā)PD-L1 上調(diào)
    1.6 結(jié)論
    綜述參考文獻
攻讀學位期間研究成果
致謝

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本文編號：2885113