背景:糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是腦血管疾病發(fā)病率以及死亡率增加的獨立性危險因素,與缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展關系密切。在急性腦梗死患者中,糖尿病病人腦梗死面積更大,臨床預后更差,死亡率也增加,但其具體機制尚未完全清楚。內(nèi)質網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulum stress,ER stress)是腦缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury,IRI)的重要機制之一,也是糖尿病和其并發(fā)癥的病理形成過程中的重要參與者。RTN1-C是內(nèi)質網(wǎng)膜相關蛋白,調(diào)節(jié)多種細胞內(nèi)通路,參與內(nèi)質網(wǎng)應激介導的細胞凋亡。有研究表明,上調(diào)RTN1-C蛋白的表達會加重腦缺血再灌注的損傷。目的:本研究擬在鼠的神經(jīng)母細胞瘤N2a氧糖剝奪后復氧(OGD/R)的損傷模型中,研究RTN1-C在高糖培養(yǎng)加重神經(jīng)細胞氧糖剝奪損傷中的作用。方法:鼠的神經(jīng)母細胞瘤N2a在含有10%的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)和傳代,接種于96孔板(100μl/孔)、12孔板(1 ml/孔)或6孔板(2 ml/孔),接種密度大約為105個/m L,接種12 h后細胞貼壁,換為高糖(HG組,30 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48h建立高糖模型。使用隨機數(shù)字表的方法,將細胞分為10組:對照組(NG-CON組)、氧糖剝奪組(NG-OGD/R組)、4-PBA預處理組(NG-OGD/R+4-PBA組)、空白轉染組(NG-sh NC組)、RTN1-C敲低轉染組(NG-sh RTN1-C組)、高糖對照組(HG-CON組)、高糖氧糖剝奪組(HG-OGD/R組)、高糖4-PBA預處理組(HG-OGD/R+4-PBA組)、高糖空白轉染組(HG-sh NC組)、高糖敲低轉染組(HG-sh RTN1-C組)。其中NG-OGD/R組、NG-OGD/R+4-PBA組、NG-sh NC組、NG-sh RTN1-C組、HG-OGD/R組、HG-OGD/R+4-PBA組、HG-sh NC組與HG-sh RTN1-C組棄去培養(yǎng)液,加入不含糖及血清的培養(yǎng)基,將培養(yǎng)板放入缺氧裝置內(nèi),并通入含有5%CO2-95%N2的混合氣平衡,缺氧培養(yǎng)3h后取出,更換為含有10%胎牛血清的相應糖的DMEM培養(yǎng)基于37℃,5%CO2-95%N2細胞孵育箱常規(guī)培養(yǎng)2h。其中NG-OGD/R+4-PBA組和HG-OGD/R+4-PBA組在氧糖剝奪前加入終濃度為2 mmol/L4-PBA的DMEM培養(yǎng)基孵育2 h;NG-OGD/R+sh NC組、HG-OGD/R+sh NC組、NG-OGD/R+sh RTN1-C組與HG-OGD/R+sh RTN1-C組在氧糖剝奪前24h,分別轉染sh NC或sh RTN1-C質粒。于復氧結束時,采用CCK-8試劑來檢測細胞活力,PE Annexin V/7-AAD流式細胞術來檢測細胞凋亡,Western Blot來檢測細胞內(nèi)蛋白RTN1-C、GRP78、cleaved-caspase-12、CHOP和cleaved-caspase-3的表達水平。結果:1.細胞活力與NG-CON組比較,NG-OGD/R組細胞活力降低(P0.05);與NG-OGD/R比較,NG-OGD/R+4-PBA組細胞活力升高(P0.05);與HG-CON組比較,HG-OGD/R組細胞活力降低(P0.05);與HG-OGD/R比較,HG-OGD/R+4-PBA組細胞活力升高(P0.05);與NG-OGD/R組比較,HG-OGD/R組細胞活力降低(P0.05);與NG-OGD/R+4-PBA組比較,HG-OGD/R+4-PBA組細胞活力無統(tǒng)計學意義(P0.05);與NG-sh NC比較,HG-sh NC組細胞活力降低(P0.05);與NG-sh RTN1-C比較,HG-sh RTN1-C組細胞活力無統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.細胞凋亡率與NG-CON組比較,NG-OGD/R組細胞的凋亡率升高(P0.05);與NG-OGD/R比較,NG-OGD/R+4-PBA組細胞凋亡率降低(P0.05);與HG-CON組比較,HG-OGD/R組細胞凋亡率升高(P0.05);與HG-OGD/R比較,HG-OGD/R+4-PBA組細胞凋亡率降低(P0.05);與NG-OGD/R組比較,HG-OGD/R組細胞凋亡率升高(P0.05);與NG-OGD/R+4-PBA組比較,HG-OGD/R+4-PBA組細胞凋亡率無統(tǒng)計學意義(P0.05);與NG-sh NC比較,HG-sh NC組細胞凋亡率升高(P0.05);與NG-sh RTN1-C比較,HG-sh RTN1-C組細胞凋亡率無統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.蛋白含量變化與NG-CON組比較,NG-OGD/R組RTN1-C、GRP78、cleaved-caspase-12、CHOP及cleaved-caspase-3蛋白含量增加(P0.05);與NG-OGD/R比較,NG-OGD/R+4-PBA組GRP78、cleaved-caspase-12、CHOP及cleaved-caspase-3蛋白含量減少(P0.05);與HG-CON組比較,HG-OGD/R組RTN1-C、GRP78、cleaved-caspase-12、CHOP及cleaved-caspase-3蛋白含量增加(P0.05);與HG-OGD/R比較,HG-OGD/R+4-PBA組GRP78、cleaved-caspase-12、CHOP及cleaved-caspase-3蛋白含量減少(P0.05);與NG-OGD/R組比較,HG-OGD/R組RTN1-C、GRP78、cleaved-caspase-12、CHOP及cleaved-caspase-3蛋白含量增加(P0.05);與NG-OGD/R+4-PBA組比較,HG-OGD/R+4-PBA組GRP78、cleaved-caspase-12、CHOP及cleaved-caspase-3蛋白含量無統(tǒng)計學意義(P0.05);與NG-sh NC比較,HG-sh NC組GRP78、cleaved-caspase-12、CHOP及cleaved-caspase-3蛋白含量增加(P0.05);與NG-sh RTN1-C比較,HG-sh RTN1-C組GRP78、cleaved-caspase-12、CHOP及cleaved-caspase-3蛋白含量無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:高糖培養(yǎng)能加重神經(jīng)細胞OGD/R的損傷,且增加神經(jīng)細胞RTN1-C蛋白含量。上調(diào)的RTN1-C加劇內(nèi)質網(wǎng)應激介導的細胞凋亡,可能是高糖加重神經(jīng)細胞OGD/R損傷的重要機制。
【學位單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R587.1;R743.3
【文章目錄】：
英文縮略詞表
中文摘要
英文摘要
1 前言
2 材料與方法
3 結果
4 討論
5 結論
6 參考文獻
附錄
致謝
綜述
    參考文獻

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本文編號：2879089