目的:體外構(gòu)建源自iPS細胞的神經(jīng)細胞惡性轉(zhuǎn)化模型,以探討惡性膠質(zhì)瘤的細胞來源。方法:首先分離培養(yǎng)正常人皮膚成纖維細胞樣本,提取細胞DNA,PCR擴增p53基因外顯子5、6、7、8和NF1基因外顯子22、32、33、38、47,測序鑒定突變熱點位置有無突變。然后應用CytoTune?-iPS 2.0 Sendai試劑盒將皮膚成纖維細胞重編程為iPS細胞,定向分化為神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞,并應用免疫細胞化學方法鑒定,接著通過流式細胞儀技術(shù)篩選純化同質(zhì)的神經(jīng)細胞群。最后,使用亞硝胺誘導星形膠質(zhì)細胞惡性轉(zhuǎn)化,并檢測細胞生長速度、軟瓊脂克隆形成能力,初步評價其是否惡性轉(zhuǎn)化。結(jié)果:正常人皮膚成纖維細胞體外分離培養(yǎng)后呈長梭形。抽提成纖維細胞DNA進行外顯子測序發(fā)現(xiàn),樣本不攜帶NF1和p53突變體。重編程成纖維細胞培養(yǎng)14天后可在顯微鏡下可見小的干細胞克隆,提取其中四個細胞克隆,免疫熒光染色顯示均表達Nanog、SSEA4、OCT4、TRA1-60、Sox2和TRA1-81這6個多能性標志分子,表明成功建立了iPS細胞系。iPS細胞定向神經(jīng)分化后的免疫熒光染色結(jié)果顯示細胞均表達特定的特異性標記物,表明神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞分化成功。初步實驗表明,亞硝胺處理星形膠質(zhì)細胞后,細胞生長速度加快,軟瓊脂克隆形成能力增強。結(jié)論:成功重編程建立了iPS細胞,并在體外構(gòu)建了源自iPS細胞的星形膠質(zhì)細胞惡性轉(zhuǎn)化模型,可為探討惡性膠質(zhì)瘤的細胞來源、特別是神經(jīng)元能否惡變提供研究模型。
【學位單位】：武漢科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R739.41
【部分圖文】：

圖 1 正常人皮膚成纖維細胞的形態(tài)（100×）A. 樣本 1；B. 樣本 2；C. 樣本 3；D. 樣本 42.2 皮膚成纖維細胞 p53 基因和 NF1 基因測序結(jié)果

圖 2 p53 基因 5、6、7、8 號外顯子電泳結(jié)果M: DNA 分子量標記，1. 樣本 1 2. 樣本 2A. p53 基因 5 號外顯子 B. p53 基因 6 號外顯子C. p53 基因 7 號外顯子 D. p53 基因 8 號外顯子

3 NF1 基因 22、32、33、38、47 號外顯子電M: DNA 分子量標記，1. 樣本 1 2. 樣本A. 樣本 1 和樣本 2 的 32、33 號外顯子B. 樣本 1 和樣本 2 的 22、38、47 號外顯B
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本文編號：2872042