細胞自噬是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質(zhì)的過程,主要功能是清除胞內(nèi)聚集的蛋白質(zhì)和受損的細胞器,并回收部分小分子如氨基酸和脂肪酸等為合成代謝提供基礎(chǔ)。自噬功能異常會導致胞內(nèi)代謝紊亂進而誘發(fā)一系列疾病。神經(jīng)細胞是種高度分化的細胞,隨著年齡的增長和活性氧等應(yīng)激的增加,胞內(nèi)容易累積異常聚集的蛋白,若因自噬功能受損不能及時清除這些聚集的蛋白,會導致神經(jīng)元死亡,進一步誘發(fā)神經(jīng)退行性病變。目前關(guān)于自噬和神經(jīng)退行性病變研究的熱點主要集中在闡述自噬的起始,底物的隔離以及溶酶體的降解機制等,關(guān)于自噬如何調(diào)控神經(jīng)元的凋亡機制尚未完全研究清楚�；谝合嗌V-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)的定量蛋白質(zhì)組學及磷酸化蛋白質(zhì)組學技術(shù)能夠大規(guī)模鑒定和定量蛋白質(zhì)水平及磷酸化位點的變化,有助于系統(tǒng)地理解如細胞周期、受體信號傳導、DNA損傷與修復、神經(jīng)突觸的信號傳遞與重塑等基本生命現(xiàn)象。本研究以兩種自噬基因突變小鼠模型為出發(fā)點,全面解析其神經(jīng)元的蛋白質(zhì)組學或磷酸化蛋白質(zhì)組學圖譜,期望闡明自噬缺失導致神經(jīng)元凋亡的機制。PINK1激酶失活突變是常染色體隱性遺傳的早發(fā)性帕金森病(Parkinson’s disease,PD)最常見的一種致病突變。近期研究表明PINK1作為蛋白激酶磷酸化Parkin、泛素等分子介導線粒體自噬從而維持細胞穩(wěn)態(tài),然而線粒體自噬對神經(jīng)元的存活和行使正常功能是否有直接影響尚未可知。我們從野生型和Pink1基因敲除小鼠腦組織中獲取神經(jīng)元進行體外培養(yǎng),建立藥物誘導線粒體膜電位去極化引發(fā)的線粒體損傷,在此基礎(chǔ)上,利用磷酸化蛋白質(zhì)組的技術(shù)大規(guī)模定量研究Pink1基因敲除后對原代神經(jīng)元磷酸化蛋白質(zhì)組的影響。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)Pink1調(diào)控的通路主要包括mTOR信號通路,神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路以及胰島素信號通路。進一步在體內(nèi)外驗證了Pink1可以直接磷酸化促凋亡蛋白BAD(Bcl2 antagonist of cell death)的S112(第112位絲氨酸)位點并抑制其促凋亡活性。在Pink1基因敲除神經(jīng)元中過表達BAD的模擬磷酸化蛋白(第112位絲氨酸S突變成天冬氨酸D)可以回復線粒體損傷導致的細胞凋亡。綜上所述,我們的研究揭示了PINK1通過直接調(diào)控促凋亡蛋白BAD的活性控制神經(jīng)元的凋亡。WDR45是螺旋槳蛋白相關(guān)的神經(jīng)退行性變(BPAN,β-propeller Protein Associated Neurodegeneration)的致病基因。WDR45屬于包含色氨酸-天冬氨酸40個氨基酸重復序列(WD40)的蛋白家族,目前的研究認為WDR45在AMPKULK1下游參與自噬調(diào)控,通過與ATG2相互作用促進自噬小體膜的延伸與形成。對WDR45在BPAN發(fā)病機制的理解僅限于明確了WDR45缺失導致細胞自噬水平發(fā)生異常,但自噬異常是否影響蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)并進一步導致神經(jīng)退行性變尚不清楚。我們利用CRISPR/CAS9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein)技術(shù)獲得全身性Wdr45基因敲除(Wdr45 KO)小鼠,行為學、電生理結(jié)果顯示W(wǎng)dr45 KO小鼠具有認知障礙與突觸傳遞障礙,免疫組化結(jié)果顯示16月齡KO小鼠前額皮質(zhì)和黑質(zhì)腦區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少。通過定量蛋白質(zhì)組學分析比較野生型和Wdr45 KO小鼠的多個腦區(qū)在發(fā)病早期蛋白質(zhì)組的變化,發(fā)現(xiàn)大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白在KO小鼠顯著積累。功能實驗發(fā)現(xiàn)Wdr45缺失的細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)面積增大,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加,激活I(lǐng)RE1α或PERK通路,最終導致神經(jīng)元凋亡。用自噬激活劑或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑可以回復KO細胞的凋亡。因此,我們初步揭示了WDR45通過維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)調(diào)控神經(jīng)元凋亡的機制。
【學位單位】：華東師范大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R741
【部分圖文】：

.1 細胞自噬細胞自噬定義最早由 Christian de Duve 于 1963 年提出：自噬是將胞內(nèi)輸至溶酶體或液泡中降解的過程[7]。自噬的底物包括可溶性因子如蛋白質(zhì)復合體如核糖體以及細胞器等[8, 9]。從降解物運送至溶酶體的途徑來看自巨自噬（macroautophagy），微自噬（microautophagy）和分子伴侶介導的chaperone-mediatedautophagy,CMA）[10,11]。巨自噬是目前研究最多的 種自噬小體將待降解物包裹，與溶酶體融合后完成降解[12]。微自噬是溶酶體陷直接吞噬細胞內(nèi)物質(zhì)，并在溶酶體中降解[13]。分子伴侶介導的自噬是指ERQ 保守序列的可溶性蛋白被分子伴侶 Hsc70 復合體識別后運輸至溶酶[14]。本課題研究對象為巨自噬，下文中涉及的自噬均為巨自噬。

1.1.2 自噬和神經(jīng)退行性病變神經(jīng)元維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)依賴于自噬，這可以從大腦通常是原發(fā)性溶酶體疾病中受影響最嚴重的器官中得到證實。因為神經(jīng)元具有異常大的樹突狀和軸突細胞質(zhì)，圖 2 哺乳動物細胞自噬過程[6]低能和饑餓誘導可以誘發(fā)自噬，具體機制是抑制 mTORC1 和活化 AMPK，其反過來通過 系列磷酸化正向調(diào)節(jié) ULK1 復合物，ULK1 復合物隨后激活 VSP34 復合物，導致前自噬體結(jié)構(gòu)中的 PI3P 合成，PI3P 通過協(xié)助募集 ATG12-ATG5-ATG16L1 復合物來定義自噬體前體的 LC3 脂化位點并維持自噬小體膜的延伸，最后被包裹的底物（例如蛋白質(zhì)聚集體，感染因子和受損線粒體）與自噬體融合后最終在溶酶體中降解。

華東師范大學博士學位論文定量（label-freequantification，LFQ）也可用于相對和絕對定量[46]，因其操作簡便和試劑成本較低，近幾年得到廣泛應(yīng)用[47]。雖然這些策略都比單純的蛋白質(zhì)鑒定更復雜，但定量蛋白質(zhì)組學對于我們理解疾病狀態(tài)的生物過程和分子機制的變化至關(guān)重要。
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本文編號：2865307