細胞自噬是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程,主要功能是清除胞內聚集的蛋白質和受損的細胞器,并回收部分小分子如氨基酸和脂肪酸等為合成代謝提供基礎。自噬功能異常會導致胞內代謝紊亂進而誘發(fā)一系列疾病。神經細胞是種高度分化的細胞,隨著年齡的增長和活性氧等應激的增加,胞內容易累積異常聚集的蛋白,若因自噬功能受損不能及時清除這些聚集的蛋白,會導致神經元死亡,進一步誘發(fā)神經退行性病變。目前關于自噬和神經退行性病變研究的熱點主要集中在闡述自噬的起始,底物的隔離以及溶酶體的降解機制等,關于自噬如何調控神經元的凋亡機制尚未完全研究清楚�；谝合嗌V-高分辨質譜聯用(LC-MS/MS)的定量蛋白質組學及磷酸化蛋白質組學技術能夠大規(guī)模鑒定和定量蛋白質水平及磷酸化位點的變化,有助于系統(tǒng)地理解如細胞周期、受體信號傳導、DNA損傷與修復、神經突觸的信號傳遞與重塑等基本生命現象。本研究以兩種自噬基因突變小鼠模型為出發(fā)點,全面解析其神經元的蛋白質組學或磷酸化蛋白質組學圖譜,期望闡明自噬缺失導致神經元凋亡的機制。PINK1激酶失活突變是常染色體隱性遺傳的早發(fā)性帕金森病(Parkinson’s disease,PD)最常見的一種致病突變。近期研究表明PINK1作為蛋白激酶磷酸化Parkin、泛素等分子介導線粒體自噬從而維持細胞穩(wěn)態(tài),然而線粒體自噬對神經元的存活和行使正常功能是否有直接影響尚未可知。我們從野生型和Pink1基因敲除小鼠腦組織中獲取神經元進行體外培養(yǎng),建立藥物誘導線粒體膜電位去極化引發(fā)的線粒體損傷,在此基礎上,利用磷酸化蛋白質組的技術大規(guī)模定量研究Pink1基因敲除后對原代神經元磷酸化蛋白質組的影響。通過生物信息學分析發(fā)現Pink1調控的通路主要包括mTOR信號通路,神經營養(yǎng)因子信號通路以及胰島素信號通路。進一步在體內外驗證了Pink1可以直接磷酸化促凋亡蛋白BAD(Bcl2 antagonist of cell death)的S112(第112位絲氨酸)位點并抑制其促凋亡活性。在Pink1基因敲除神經元中過表達BAD的模擬磷酸化蛋白(第112位絲氨酸S突變成天冬氨酸D)可以回復線粒體損傷導致的細胞凋亡。綜上所述,我們的研究揭示了PINK1通過直接調控促凋亡蛋白BAD的活性控制神經元的凋亡。WDR45是螺旋槳蛋白相關的神經退行性變(BPAN,β-propeller Protein Associated Neurodegeneration)的致病基因。WDR45屬于包含色氨酸-天冬氨酸40個氨基酸重復序列(WD40)的蛋白家族,目前的研究認為WDR45在AMPKULK1下游參與自噬調控,通過與ATG2相互作用促進自噬小體膜的延伸與形成。對WDR45在BPAN發(fā)病機制的理解僅限于明確了WDR45缺失導致細胞自噬水平發(fā)生異常,但自噬異常是否影響蛋白質質量控制系統(tǒng)并進一步導致神經退行性變尚不清楚。我們利用CRISPR/CAS9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein)技術獲得全身性Wdr45基因敲除(Wdr45 KO)小鼠,行為學、電生理結果顯示Wdr45 KO小鼠具有認知障礙與突觸傳遞障礙,免疫組化結果顯示16月齡KO小鼠前額皮質和黑質腦區(qū)神經元數量減少。通過定量蛋白質組學分析比較野生型和Wdr45 KO小鼠的多個腦區(qū)在發(fā)病早期蛋白質組的變化,發(fā)現大量內質網蛋白在KO小鼠顯著積累。功能實驗發(fā)現Wdr45缺失的細胞內質網面積增大,內質網應激增加,激活IRE1α或PERK通路,最終導致神經元凋亡。用自噬激活劑或內質網應激抑制劑可以回復KO細胞的凋亡。因此,我們初步揭示了WDR45通過維持內質網穩(wěn)態(tài)調控神經元凋亡的機制。
【學位單位】：華東師范大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R741
【部分圖文】：

.1 細胞自噬細胞自噬定義最早由 Christian de Duve 于 1963 年提出：自噬是將胞內輸至溶酶體或液泡中降解的過程[7]。自噬的底物包括可溶性因子如蛋白質復合體如核糖體以及細胞器等[8, 9]。從降解物運送至溶酶體的途徑來看自巨自噬（macroautophagy），微自噬（microautophagy）和分子伴侶介導的chaperone-mediatedautophagy,CMA）[10,11]。巨自噬是目前研究最多的 種自噬小體將待降解物包裹，與溶酶體融合后完成降解[12]。微自噬是溶酶體陷直接吞噬細胞內物質，并在溶酶體中降解[13]。分子伴侶介導的自噬是指ERQ 保守序列的可溶性蛋白被分子伴侶 Hsc70 復合體識別后運輸至溶酶[14]。本課題研究對象為巨自噬，下文中涉及的自噬均為巨自噬。

1.1.2 自噬和神經退行性病變神經元維持胞內穩(wěn)態(tài)依賴于自噬，這可以從大腦通常是原發(fā)性溶酶體疾病中受影響最嚴重的器官中得到證實。因為神經元具有異常大的樹突狀和軸突細胞質，圖 2 哺乳動物細胞自噬過程[6]低能和饑餓誘導可以誘發(fā)自噬，具體機制是抑制 mTORC1 和活化 AMPK，其反過來通過 系列磷酸化正向調節(jié) ULK1 復合物，ULK1 復合物隨后激活 VSP34 復合物，導致前自噬體結構中的 PI3P 合成，PI3P 通過協(xié)助募集 ATG12-ATG5-ATG16L1 復合物來定義自噬體前體的 LC3 脂化位點并維持自噬小體膜的延伸，最后被包裹的底物（例如蛋白質聚集體，感染因子和受損線粒體）與自噬體融合后最終在溶酶體中降解。

華東師范大學博士學位論文定量（label-freequantification，LFQ）也可用于相對和絕對定量[46]，因其操作簡便和試劑成本較低，近幾年得到廣泛應用[47]。雖然這些策略都比單純的蛋白質鑒定更復雜，但定量蛋白質組學對于我們理解疾病狀態(tài)的生物過程和分子機制的變化至關重要。
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本文編號：2865307