目的:dynactin是突觸-胞質(zhì)逆行運(yùn)輸復(fù)合物成員之一,在突觸到胞質(zhì)的運(yùn)輸途徑中起重要作用。正常人大腦中dynactin表達(dá)隨年齡增加而增加,帕金森病患者大腦中dynactin表達(dá)卻在隨年齡增加而減少,提示dynactin的變化可能和帕金森病發(fā)生機(jī)制有關(guān)。為尋找帕金森病早期病變即多巴胺神經(jīng)元退行性病變的原因,為帕金森病早期診斷提供依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)圍繞dynactin展開(kāi),研究其功能障礙是否會(huì)造成帕金森病樣癥狀,是否會(huì)造成多巴胺神經(jīng)元退行性病變,如果造成多巴胺神經(jīng)元退行性病變,那么其機(jī)制有哪些,是否會(huì)造成synuclein等蛋白異常聚集及自噬體增加。如果造成,其機(jī)制是否與dynactin逆行性軸漿運(yùn)輸這一功能受影響有關(guān)。材料與方法:本實(shí)驗(yàn)研究方法分為體內(nèi)與體外兩部分。(1)體內(nèi)實(shí)驗(yàn),利用濃度梯度dynactin特異性抑制劑MB抑制Tg(Vmat2-GFP)斑馬魚(yú)dynactin表達(dá)構(gòu)建斑馬魚(yú)模型,通過(guò)統(tǒng)計(jì)生存率;觀察斑馬魚(yú)外形變化、行為學(xué)改變;使用運(yùn)動(dòng)速率實(shí)驗(yàn)、明暗室實(shí)驗(yàn),并與MPTP帕金森病斑馬魚(yú)模型比較,系統(tǒng)評(píng)估與帕金森病樣癥狀相識(shí)與不同。使用活細(xì)胞工作站,激光共聚焦等設(shè)備,實(shí)時(shí)觀察間腦多巴胺神經(jīng)元數(shù)量變化;通過(guò)整胚免疫熒光方法觀察synuclein聚集情況。(2)體外實(shí)驗(yàn),dynactin-siRNA敲降SH-SY5Y細(xì)胞系。熒光免疫觀察細(xì)胞內(nèi)synuclein表達(dá),在SH-SY5Y細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染mTagRFP-mWasabi-LC3觀察Wasabi與TagRFP表達(dá)及分布,使用WB測(cè)定LC3-II,P62表達(dá)水平判斷自噬流途徑。使用活細(xì)胞工作站、激光共聚焦等設(shè)備觀察穩(wěn)轉(zhuǎn)synuclein-GFP質(zhì)粒和mTagRFP-mWasabi-LC3質(zhì)粒后細(xì)胞內(nèi)軸突運(yùn)輸狀態(tài)。免疫熒光雙標(biāo)dynactin和dynein確定逆行性軸漿運(yùn)輸受阻狀況。結(jié)果:(1)抑制斑馬魚(yú)dynactin表達(dá)后,斑馬魚(yú)胚胎、幼魚(yú)存活率及孵化效率下降,胚胎孵化延遲,尾部彎曲畸形,脊柱僵直,平衡失態(tài),震顫,心包水腫。斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)能力減弱,表現(xiàn)為自由運(yùn)動(dòng)速率和機(jī)械刺激后運(yùn)動(dòng)速率減慢。通過(guò)觀察活體Tg(Vmat2-GFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)間腦多巴胺神經(jīng)元情況,發(fā)現(xiàn)降低dynactin的表達(dá)造成多巴胺神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。(2)在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)降低dynactin表達(dá),造成帕金森病相關(guān)基因表達(dá)變化,synuclein蛋白大量聚集且分布異常,主要在軸突和胞質(zhì)近軸突端大量聚集。在dynactin-siRNA敲降組中,由LC3標(biāo)記的自噬小泡在胞質(zhì)近軸突端和膜周圍大量聚集,這與典型的誘導(dǎo)自噬途徑不同,自噬體并不以核周增多為主。結(jié)合WB結(jié)果證明自噬流誘導(dǎo)途徑增加,dynactin的減少造成自噬體位置的改變,可能是造成synuclein最終聚集在上述位置的原因之一。(3)實(shí)時(shí)觀察SH-SY5Y細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)形成大量神經(jīng)珠,且synuclein和LC3的軸漿逆行性運(yùn)輸發(fā)生障礙。逆行軸漿運(yùn)輸dynein-dynactin復(fù)合體形成減少,分布異常,由散在分布變?yōu)樵诎|(zhì)近軸突端和突觸集中分布。dynactin減少造成逆行軸漿運(yùn)輸障礙,導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元退行病變。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)確立mycalolide B(MB)濃度為33.4~50.3μg/L區(qū)間內(nèi)建立的斑馬魚(yú)模型,在行為學(xué)與形態(tài)學(xué)上和傳統(tǒng)MPTP建立的帕金森病動(dòng)物模型相似,說(shuō)明dynactin降低造成類帕金森病癥狀,主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)能力減弱,姿態(tài)異常等。特異敲降和抑制dynactin,斑馬魚(yú)多巴胺神經(jīng)元減少,說(shuō)明抑制dynactin造成多巴胺神經(jīng)退行性病變。斑馬魚(yú)和SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)synuclein大量聚集胞質(zhì)近軸突端和突觸與路易士小體形成部位一致,提示dynactin功能障礙產(chǎn)生帕金森病樣病理變化。LC3近軸突端和膜周圍大量聚集特點(diǎn)可能和synuclein在胞質(zhì)近軸突端和突觸聚集有關(guān),而且與通過(guò)WB證實(shí)的自噬流誘導(dǎo)途徑增加現(xiàn)象推測(cè)可能是逆行性軸漿運(yùn)輸障礙造成�；罴�(xì)胞觀察細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸,以及synuclein,LC3運(yùn)輸,dynein和dynactin分布異常都提示細(xì)胞內(nèi)逆行性軸漿運(yùn)輸障礙。綜上所述,dynactin減少導(dǎo)致逆行性軸漿運(yùn)輸受阻,進(jìn)而造成synuclein蛋白在軸突和胞質(zhì)近軸突端聚集,代謝受阻,自噬增加,最終導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元退行病變。
【學(xué)位單位】：成都醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R742.5
【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
第一部分 降低dynactin表達(dá)在多巴胺神經(jīng)元退行性變的作用
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)
        2.2 試劑、耗材和儀器
        2.3 主要試劑的配制
        2.4 主要實(shí)驗(yàn)方法
        2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 MB與MPTP致斑馬魚(yú)胚胎（幼魚(yú)）存活率及孵化效率下降
        3.2 MB與MPTP對(duì)斑馬魚(yú)外觀的影響
        3.3 MB與MPTP致斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)能力減弱
        3.4 降低dynactin表達(dá)造成斑馬魚(yú)Vmat2陽(yáng)性神經(jīng)元減少
    4 討論
    5 小結(jié)
第二部分 敲降dynactin造成synuclein聚集且誘導(dǎo)自噬
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)及分組
        2.2 試劑、耗材和儀器
        2.3 主要試劑的配制
        2.4 實(shí)驗(yàn)方法
        2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 dynactin表達(dá)減少造成帕金森病相關(guān)基因表達(dá)異常
        3.2 敲降SH-SY5Y細(xì)胞dynactin導(dǎo)致synuclein聚集
        3.3 敲降dynactin造成大量自噬泡形成
        3.4 通過(guò)誘導(dǎo)途徑使自噬體增加
    4 討論
    5 小結(jié)
第三部分 敲降dynactin導(dǎo)致逆行軸漿運(yùn)輸受阻
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞構(gòu)建
        2.2 試劑、耗材和儀器
        2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 敲降dynactin造成逆行軸漿運(yùn)輸障礙
        3.2 敲降dynactin致α-synuclein軸漿逆行性運(yùn)輸受阻
        3.3 dynactin敲降后,dynein分布異常
    4 討論
    5 小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間研究成果
致謝

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