為進(jìn)一步研究IKKε的癌基因作用是否對惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Hippo信號通路具有調(diào)控功能,從而進(jìn)一步擴(kuò)展惡性膠質(zhì)瘤中Hippo信號通路交叉網(wǎng)絡(luò)以及發(fā)現(xiàn)新的下游促膠質(zhì)瘤增殖和侵襲的因子和機(jī)制,研究通過應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)(co-immunoprecipitation,co-IP)和蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western-blot,WB)結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法初步研究探索IKKε與Yes相關(guān)蛋白1(YAP1)外源性和內(nèi)源性相互結(jié)合作用。經(jīng)上述初步研究后繼續(xù)初步探索IKKε對YAP1表達(dá)的影響以及對其在LATS2-YAP1磷酸化級聯(lián)反應(yīng)以及YAP1下游相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,并在此基礎(chǔ)上探索IKKε對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和增殖能力的影響。方法第一部分:外源性IKKε和YAP1的相互作用研究:將重組質(zhì)粒pCDNA3-IKKε-flag與HA-YAP1共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中,后經(jīng)過免疫印跡驗(yàn)證IKKε及YAP1在HEK293細(xì)胞中有效表達(dá),并進(jìn)一步使用anti-Flag抗體對HEK293細(xì)胞提取總蛋白后所得總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀(co-IP),同時(shí)應(yīng)用SDS-PAGE膠進(jìn)行沉淀物電泳,應(yīng)用anti-Flag抗體驗(yàn)證沉淀物中是否富集IKKε蛋白,應(yīng)用anti-HA抗體鑒定富集的蛋白復(fù)合物中是否存在YAP1蛋白。同法,反向進(jìn)行以進(jìn)一步驗(yàn)證anti-HA富集的蛋白復(fù)合物中是否存在IKKε蛋白。內(nèi)源性相互作用研究:提取膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG細(xì)胞總蛋白,并驗(yàn)證IKKε及YAP1的表達(dá)情況,應(yīng)用anti-IKKε抗體對細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫沉淀,同時(shí)應(yīng)用正常兔IgG對細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫沉淀,作為陰性對照;進(jìn)而應(yīng)用WB對免疫沉淀所得復(fù)合物進(jìn)行驗(yàn)證,應(yīng)用anti-YAP1鑒定anti-IKKε結(jié)合所得蛋白中是否存在YAP1蛋白。接著,同法進(jìn)行反向驗(yàn)證,anti-YAP1對提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫沉淀,WB對免疫沉淀所得復(fù)合物進(jìn)行驗(yàn)證,anti-IKKε鑒定anti-YAP1結(jié)合蛋白中是否存在IKKε蛋白。第二部分:我們應(yīng)用慢病毒載體的IKKε-sh RNA體外轉(zhuǎn)染U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,敲低IKKε表達(dá)后western-blot檢測YAP1及P-YAP1(S127)、以及LATS2的表達(dá)變化,繼之提取胞漿和胞核蛋白驗(yàn)證YAP1及P-YAP1(S127)在胞漿及胞核中的變化。以及提取總蛋白驗(yàn)證YAP1下游相關(guān)基因的表達(dá)變化,如c-myc、CTGF、cdk-6的變化。然后應(yīng)用小干擾RNA技術(shù)敲低YAP1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá),并同樣檢測yap1下游相關(guān)蛋白表達(dá)變化。應(yīng)用細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、mtt細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染ikkε-shrna后的細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖能力;應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染ikkε-shrna后對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲力的影響情況。結(jié)果1.外源性驗(yàn)證:重組質(zhì)粒pcdna3-ikkε-flag與ha-yap1共轉(zhuǎn)染至hek293細(xì)胞后成功表達(dá),且經(jīng)免疫共沉淀方法雙向驗(yàn)證證明ikkε結(jié)合蛋白中包含yap1蛋白;同時(shí),yap1蛋白結(jié)合所得蛋白中包含ikkε。2.內(nèi)源性驗(yàn)證:提取u87mg膠質(zhì)瘤細(xì)胞總蛋白后,wb驗(yàn)證ikkε及yap1在u87膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)。anti-ikkε進(jìn)行免疫沉淀,ib驗(yàn)證anti-ikkε結(jié)合的蛋白中包含yap1。反向ib驗(yàn)證anti-yap1結(jié)合蛋白中包含ikkε蛋白。3.第二部分抑制了ikkε表達(dá)之后,yap1蛋白的表達(dá)水平也同時(shí)降低,這也同時(shí)進(jìn)一步驗(yàn)證了我們前一部分對二者相互作用的猜想,c-myc、ctgf、cdk-6等的表達(dá)水平也因之而降低;我們應(yīng)用si-yap1抑制yap1蛋白表達(dá),同時(shí)檢測其下游的c-myc、ctgf、cdk-6,其變化趨勢如前,其表達(dá)水平也降低,提示我們,也同時(shí)給予我們一個(gè)驗(yàn)證結(jié)論:ikkε能夠參與hippo信號通路的調(diào)控,從而進(jìn)一步參與調(diào)控惡性膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為;胞漿、胞核蛋白分別驗(yàn)證yap1及p-yap1(s-127)在胞漿及胞核中水平的變化,得到敲低ikkε表達(dá)后胞漿中yap1蛋白水平降低,同時(shí)胞核中水平降低;而lats2蛋白水平升高,提取總蛋白中p-yap1(s127)水平升高,胞漿中p-yap1(s127)升高,胞核中也有同樣表現(xiàn),較未轉(zhuǎn)染組水平升高。體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證膠質(zhì)瘤細(xì)胞u87的惡性細(xì)胞學(xué)行為的變化,如前實(shí)驗(yàn)結(jié)果所述,經(jīng)過劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell侵襲實(shí)驗(yàn),細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力被抑制;細(xì)胞周期變化檢測,mtt細(xì)胞增殖檢測以及細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)等驗(yàn)證了經(jīng)轉(zhuǎn)染慢病毒處理后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的增殖能力受到抑制。結(jié)論1.ikkε與yap1存在直接或間接的相互作用關(guān)系,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究,可能與其對hippo信號通路的調(diào)控功能有關(guān)。2.抑制ikkε表達(dá),u87細(xì)胞的增殖和侵襲能力均有減弱,且抑制ikkε表達(dá)之后,yap1下游相關(guān)蛋白如c-myc、ctgf、cdk-6等的表達(dá)水平也因之而降低,此外,胞漿、胞核蛋白分別驗(yàn)證YAP1及p-YAP1(s-127)在胞漿及胞核中水平的變化,得到敲低IKKε表達(dá)后胞漿中YAP1蛋白水平降低,同時(shí)胞核中水平降低;而LATS2蛋白水平升高,這說明IKKε可以參與Hippo信號通路的磷酸化級聯(lián)調(diào)控,進(jìn)而對膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87的增殖及侵襲能力進(jìn)行調(diào)控。具體機(jī)制有待繼續(xù)研究。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R739.41
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略語/符號說明
前言
    研究現(xiàn)狀、成果
    研究目的、方法
一、IKKε與YAP1在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中相互作用的初步研究
    1.1 材料和方法
        1.1.1 材料
        1.1.2 方法
            外源性相互作用驗(yàn)證
            內(nèi)源性相互作用驗(yàn)證
    1.2 結(jié)果
    1.3 討論
    1.4 小結(jié)
二、IKKε通過YAP1調(diào)控惡性膠質(zhì)瘤生長和侵襲的體外研究
    2.1 材料與方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 方法
    2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2.3 結(jié)果
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
發(fā)表論文和參加科研情況說明
附錄
綜述 Hippo-YAP在腫瘤中的新作用的研究進(jìn)展
    綜述參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡歷

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本文編號：2862103