研究背景缺血性腦卒中(ischemia stroke,IS)是目前我國(guó)發(fā)病率較高的疾病,2013年流行病學(xué)調(diào)查顯示,我國(guó)卒中年標(biāo)準(zhǔn)化患病率1114.8/10萬(wàn)、發(fā)病率246.8/10萬(wàn)、病死率為114.8/10萬(wàn)~([1])。近年來(lái),歐美國(guó)家卒中發(fā)病率和病死率逐漸下降,而我國(guó)的發(fā)病率,卻以每年8.7%的速度增長(zhǎng),顯著高于世界卒中總體年發(fā)病率~([2]),腦卒中已成為我國(guó)公民的第一位死亡原因,最新數(shù)據(jù)顯示,新發(fā)患者中,缺血性卒中占總體的70%~([3])。急性缺血性卒中的救治水平關(guān)系到我國(guó)居民的健康,其高發(fā)病率、高致殘率,高病死率,給患者和家庭帶來(lái)巨大的痛苦,對(duì)社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)~([4])。近年來(lái),雖然投入大量研究了解缺血性腦卒中機(jī)制,但對(duì)于缺血性腦卒中的治療,仍缺乏明確有效的治療措施。研究表明,IS后神經(jīng)元不僅發(fā)生凋亡與壞死,還可發(fā)生自噬,但其在IS后神經(jīng)功能障礙中的作用尚存在爭(zhēng)議。而一類線粒體去乙�；浮猄IRT3在神經(jīng)元損傷后表達(dá)增高,其可能參與能量代謝、細(xì)胞凋亡、生存信號(hào)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。以往研究表明SIRT3在老年性心肌反應(yīng)性肥大、腫瘤及衰老等相關(guān)疾病中發(fā)揮保護(hù)作用。然而,SIRT3在缺血性腦卒中如何發(fā)揮作用及其機(jī)制,目前尚未得到明確肯定。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.觀察不同時(shí)長(zhǎng)氧糖剝奪再灌注(Oxygen-glucose deprivation-reperfusion,OGD/R)對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能損傷的影響;2.觀察神經(jīng)元自噬相關(guān)分子LC3、P62、PINK1、Parkin和Cleaved caspase-3的時(shí)空變化規(guī)律;3.觀察神經(jīng)元自噬和SIRT3蛋白的相關(guān)性;4.探討自噬水平對(duì)OGD/R損傷后對(duì)神經(jīng)元活性和凋亡的影響;5.探討SIRT3分子在OGD/R損傷后神經(jīng)元自噬與損傷的關(guān)系和作用,為腦缺血損傷治療提供新的切入點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)方法1.通過(guò)原代小鼠皮層神經(jīng)元離體培養(yǎng),利用缺氧孵箱模擬缺氧環(huán)境,建立神經(jīng)元氧糖剝奪再灌注離體損傷模型,模擬缺血性腦卒中再灌注損傷。2.光鏡下觀察小鼠皮層神經(jīng)元OGD/R損傷的形態(tài)學(xué)改變;采用細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑(Cell Counting Kit-8,CCK-8)和乳酸脫氫酶(Lacatate dehydrogenase,LDH)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力,評(píng)價(jià)OGD/R后神經(jīng)元損傷。3.蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blot)和免疫熒光的方法檢測(cè)OGD/R后自噬、線粒體自噬、凋亡相關(guān)分子和SIRT3蛋白的時(shí)空表達(dá)。4.采用自噬激動(dòng)劑RAPA和自噬抑制劑3-MA,調(diào)節(jié)OGD/R處理后自噬水平,觀察自噬對(duì)神經(jīng)元的影響作用。5.采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)SIRT3的表達(dá),建立OGD/R損傷模型,觀察損傷后形態(tài)學(xué)改變,LDH釋放檢測(cè)和CCK-8活力檢測(cè),評(píng)價(jià)神經(jīng)元損傷情況;應(yīng)用原位末端標(biāo)記(terminal Dutp nick end labelling,TUNEL)方法檢測(cè)小鼠皮層神經(jīng)元凋亡改變。6.采用蛋白免疫印跡技術(shù)和免疫熒光的方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)SIRT3小鼠皮層神經(jīng)元OGD/R損傷后自噬、線粒體自噬、凋亡相關(guān)分子等相關(guān)蛋白的水平改變。7.采用自噬激動(dòng)劑(RAPA)和自噬抑制劑(3-MA),調(diào)節(jié)自噬水平,觀察OGD/R損傷后自噬對(duì)過(guò)SIRT3小鼠皮層神經(jīng)元影響作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果第一部分研究發(fā)現(xiàn):(1)小鼠皮層神經(jīng)元對(duì)缺血、缺氧敏感,OGD/R可明顯損害正常神經(jīng)元形態(tài),隨著OGD/R損傷時(shí)間延長(zhǎng),形態(tài)改變?cè)矫黠@;與正常對(duì)照組比較,LDH釋放量呈進(jìn)行性升高,細(xì)胞活性呈進(jìn)展性下降趨勢(shì),各組差異性顯著(P0.01)。表明OGD/R損傷神經(jīng)元活性與時(shí)間呈正相關(guān);(2)蛋白免疫印跡發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組相比,LC3-II在OGD4h時(shí)表達(dá)最高,P62在OGD2h增高,OGD4h下降,表明自噬水平顯著增高(P0.05),PINK1在OGD4h時(shí)表達(dá)最高,Parkin蛋白在OGD/R損傷后整體表達(dá)下降(P0.05);Cleaved caspase-3表達(dá)在損傷開始即出現(xiàn)明顯增高,在OGD4h以后出現(xiàn)平臺(tái)期,但表達(dá)仍進(jìn)一步增高(P0.01)。SIRT3表達(dá)與LC3-II、PINK1相似,在OGD/R處理后表達(dá)整體上調(diào),并于OGD 4h達(dá)峰值后逐漸下降,表達(dá)呈類拋物線狀;(3)通過(guò)自噬抑制劑(3-MA)和自噬激動(dòng)劑(RAPA)調(diào)解自噬水平,CCK-8檢測(cè)和Western blot檢測(cè)結(jié)果提示,與OGD4h組相比,抑制自噬,細(xì)胞活力下降,凋亡表達(dá)增加;提高自噬,細(xì)胞活力增高,凋亡表達(dá)減少。本部分研究表明:OGD/R損傷可激活神經(jīng)元自噬,在4h是自噬水平達(dá)到最高峰,SIRT3可能通過(guò)參與自噬過(guò)程,減少細(xì)胞凋亡。在早期,適度上調(diào)自噬在一定程度上可以減少細(xì)胞凋亡,發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元的作用。第二部分研究發(fā)現(xiàn):(1)過(guò)表達(dá)SIRT3可明顯改善OGD/R處理后小鼠皮層神經(jīng)元損傷形態(tài),增強(qiáng)神經(jīng)元活性,減少細(xì)胞凋亡率;(2)蛋白免疫印跡和免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn),與OGD4h組比較,過(guò)表達(dá)SIRT3后OGD/R損傷小鼠神經(jīng)元LC3-Ⅱ、PINK1表達(dá)增高(P0.05),Cleaved caspase-3表達(dá)下降(P0.05);進(jìn)一步免疫熒光檢測(cè)結(jié)果印證了,SIRT3表達(dá)上調(diào),LC3-Ⅱ點(diǎn)狀熒光增強(qiáng),自噬增加,Caspase-3表達(dá)減少,細(xì)胞凋亡減少;(3)CCK-8檢測(cè)和Western blot檢測(cè)結(jié)果提示,通過(guò)3-MA抑制自噬和RAPA上調(diào)自噬表明,抑制自噬,過(guò)表達(dá)SIRT3神經(jīng)元自噬顯著降低,細(xì)胞活性降低,損傷加重,凋亡減少;提高自噬,過(guò)表達(dá)SIRT3小鼠神經(jīng)元自噬增強(qiáng),細(xì)胞活性增高,凋亡減少。本部分研究表明:過(guò)表達(dá)SIRT3可明顯改善OGD/R處理后的神經(jīng)元損傷,減少細(xì)胞凋亡,發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用;抑制自噬,可以抵消SIRT3保護(hù)神經(jīng)元作用,提高自噬,可以增加SIRT3對(duì)OGD/R損傷的拮抗作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)論本研究證實(shí):OGD/R損傷可激活神經(jīng)元自噬,OGD4h是自噬水平的最高峰。在4h以內(nèi),適度上調(diào)自噬在一定程度上可以減少細(xì)胞凋亡,發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元的作用;過(guò)表達(dá)SIRT3小鼠皮層神經(jīng)元抵抗OGD/R損傷能力提高,細(xì)胞活性增強(qiáng);SIRT3可能通過(guò)調(diào)控自噬發(fā)生,抑制神經(jīng)元凋亡,參與了拮抗神經(jīng)元缺血損傷,發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R743
【部分圖文】：

空軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡；如 CBF 持續(xù)每分鐘低于 10ml/min 時(shí)，腦損傷不可逆現(xiàn)永久性梗死；如腦血流量減少至 5ml/min，僅 30min 即可出現(xiàn)梗死[4性腦卒中的病理變化前，缺血性腦卒中的具體分子機(jī)制并不明確，可能與：能量代謝障礙、性、鈣離子超載、和細(xì)胞炎性因子、氧自由基清除障礙等有關(guān)[6, 7]。從注后導(dǎo)致細(xì)胞損傷及死亡的信號(hào)通路中，我們可以看出，線粒體的能量因素，又是介導(dǎo)損傷的中心環(huán)節(jié)[7]（圖 1）。

圖 2 自噬分類（Noboru Mizushinma et al. Nature, 2008）體自噬體具有能量轉(zhuǎn)化、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、協(xié)同鈣離子等功能，氧化代謝，為細(xì)胞提供能量的場(chǎng)所。線粒體呼吸活動(dòng)的副產(chǎn)物是超化氫和羥基自由基等活性氧的形成。ROS攻擊蛋白質(zhì)、脂類和核酸鏈反應(yīng)。目前認(rèn)為，線粒體不僅為細(xì)胞提供能量，還參與了細(xì)胞的號(hào)傳導(dǎo)以及鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控等過(guò)程。目前研究已證實(shí)：細(xì)胞內(nèi)成分，包物質(zhì)和細(xì)胞器可以被特異性的被選擇消化降解，例如線粒體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬、核糖體自噬[71]。而作為自噬的形式之一，目前研究較噬，是細(xì)胞通過(guò)自噬機(jī)制特異性清除受損的線粒體的過(guò)程[72, 73]。 Du微鏡第一次在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)線粒體自噬[74]。它是一種選擇性粒體有針對(duì)性自噬降解的形式，線粒體自噬清除線粒體功能失調(diào)和

-35-至7d左右，細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則的梭形或類橢圓形，胞核清晰，核仁明顯，神經(jīng)元突起較長(zhǎng)，呈放射狀，相互聯(lián)系，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)連接 (圖1A)。經(jīng)氧糖剝奪處理2h后神經(jīng)元貼壁能力下降，部分細(xì)胞腫脹，胞體折光性減小，突觸部分?jǐn)嗔�，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)尚存(圖1B)；至OGD4h后神經(jīng)元折光性降低，胞體、細(xì)胞核固縮，細(xì)胞間隙增大，包漿內(nèi)可見空泡樣改變，突觸呈斷續(xù)串珠樣，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞(圖1C) ；OGD8h后神經(jīng)元碎片化，突觸膨脹斷裂，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)幾乎消失，細(xì)胞之間失去網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系(圖1D) 。圖 1： 經(jīng) OGD 損傷后的各組神經(jīng)元的形態(tài)圖（×200）3.2 OGD/R 處理對(duì)小鼠皮層神經(jīng)元損傷的影響經(jīng)不同時(shí)長(zhǎng) OGD/R 處理后，CCK-8 檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著 OGD/R 損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，可造成細(xì)胞活性呈進(jìn)展性下降趨勢(shì)，與正常對(duì)照組比較，各組間存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖 2）。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 陳璐勔;羅艷琳;趙麗;韓松;李淑娟;李俊發(fā);;細(xì)胞自噬緩解氧-糖剝奪誘導(dǎo)原代培養(yǎng)小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元缺血損傷[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2014年12期

2 常明則;吳海琴;喬琳;王新來(lái);狄政莉;劉志勤;毛佳;田曄;;腦缺血再灌注后大鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)SIRT_3的表達(dá)特點(diǎn)[J];陜西醫(yī)學(xué)雜志;2014年05期

3 汪文英;崔德榮;江偉;;自噬在大腦缺血再灌注損傷中作用的研究進(jìn)展[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2014年02期

4 ;中國(guó)缺血性腦卒中和短暫性腦缺血發(fā)作二級(jí)預(yù)防指南(2010)[J];中國(guó)臨床醫(yī)生;2011年11期

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