研究背景缺血性腦卒中(ischemia stroke,IS)是目前我國發(fā)病率較高的疾病,2013年流行病學調查顯示,我國卒中年標準化患病率1114.8/10萬、發(fā)病率246.8/10萬、病死率為114.8/10萬~([1])。近年來,歐美國家卒中發(fā)病率和病死率逐漸下降,而我國的發(fā)病率,卻以每年8.7%的速度增長,顯著高于世界卒中總體年發(fā)病率~([2]),腦卒中已成為我國公民的第一位死亡原因,最新數(shù)據(jù)顯示,新發(fā)患者中,缺血性卒中占總體的70%~([3])。急性缺血性卒中的救治水平關系到我國居民的健康,其高發(fā)病率、高致殘率,高病死率,給患者和家庭帶來巨大的痛苦,對社會造成沉重的經濟負擔~([4])。近年來,雖然投入大量研究了解缺血性腦卒中機制,但對于缺血性腦卒中的治療,仍缺乏明確有效的治療措施。研究表明,IS后神經元不僅發(fā)生凋亡與壞死,還可發(fā)生自噬,但其在IS后神經功能障礙中的作用尚存在爭議。而一類線粒體去乙�；浮猄IRT3在神經元損傷后表達增高,其可能參與能量代謝、細胞凋亡、生存信號通路的關鍵環(huán)節(jié)。以往研究表明SIRT3在老年性心肌反應性肥大、腫瘤及衰老等相關疾病中發(fā)揮保護作用。然而,SIRT3在缺血性腦卒中如何發(fā)揮作用及其機制,目前尚未得到明確肯定。實驗目的1.觀察不同時長氧糖剝奪再灌注(Oxygen-glucose deprivation-reperfusion,OGD/R)對神經元結構和功能損傷的影響;2.觀察神經元自噬相關分子LC3、P62、PINK1、Parkin和Cleaved caspase-3的時空變化規(guī)律;3.觀察神經元自噬和SIRT3蛋白的相關性;4.探討自噬水平對OGD/R損傷后對神經元活性和凋亡的影響;5.探討SIRT3分子在OGD/R損傷后神經元自噬與損傷的關系和作用,為腦缺血損傷治療提供新的切入點。實驗方法1.通過原代小鼠皮層神經元離體培養(yǎng),利用缺氧孵箱模擬缺氧環(huán)境,建立神經元氧糖剝奪再灌注離體損傷模型,模擬缺血性腦卒中再灌注損傷。2.光鏡下觀察小鼠皮層神經元OGD/R損傷的形態(tài)學改變;采用細胞增殖-毒性檢測試劑(Cell Counting Kit-8,CCK-8)和乳酸脫氫酶(Lacatate dehydrogenase,LDH)試劑盒檢測細胞活力,評價OGD/R后神經元損傷。3.蛋白免疫印跡技術(Western blot)和免疫熒光的方法檢測OGD/R后自噬、線粒體自噬、凋亡相關分子和SIRT3蛋白的時空表達。4.采用自噬激動劑RAPA和自噬抑制劑3-MA,調節(jié)OGD/R處理后自噬水平,觀察自噬對神經元的影響作用。5.采用慢病毒轉染技術上調SIRT3的表達,建立OGD/R損傷模型,觀察損傷后形態(tài)學改變,LDH釋放檢測和CCK-8活力檢測,評價神經元損傷情況;應用原位末端標記(terminal Dutp nick end labelling,TUNEL)方法檢測小鼠皮層神經元凋亡改變。6.采用蛋白免疫印跡技術和免疫熒光的方法檢測過表達SIRT3小鼠皮層神經元OGD/R損傷后自噬、線粒體自噬、凋亡相關分子等相關蛋白的水平改變。7.采用自噬激動劑(RAPA)和自噬抑制劑(3-MA),調節(jié)自噬水平,觀察OGD/R損傷后自噬對過SIRT3小鼠皮層神經元影響作用。實驗結果第一部分研究發(fā)現(xiàn):(1)小鼠皮層神經元對缺血、缺氧敏感,OGD/R可明顯損害正常神經元形態(tài),隨著OGD/R損傷時間延長,形態(tài)改變越明顯;與正常對照組比較,LDH釋放量呈進行性升高,細胞活性呈進展性下降趨勢,各組差異性顯著(P0.01)。表明OGD/R損傷神經元活性與時間呈正相關;(2)蛋白免疫印跡發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,LC3-II在OGD4h時表達最高,P62在OGD2h增高,OGD4h下降,表明自噬水平顯著增高(P0.05),PINK1在OGD4h時表達最高,Parkin蛋白在OGD/R損傷后整體表達下降(P0.05);Cleaved caspase-3表達在損傷開始即出現(xiàn)明顯增高,在OGD4h以后出現(xiàn)平臺期,但表達仍進一步增高(P0.01)。SIRT3表達與LC3-II、PINK1相似,在OGD/R處理后表達整體上調,并于OGD 4h達峰值后逐漸下降,表達呈類拋物線狀;(3)通過自噬抑制劑(3-MA)和自噬激動劑(RAPA)調解自噬水平,CCK-8檢測和Western blot檢測結果提示,與OGD4h組相比,抑制自噬,細胞活力下降,凋亡表達增加;提高自噬,細胞活力增高,凋亡表達減少。本部分研究表明:OGD/R損傷可激活神經元自噬,在4h是自噬水平達到最高峰,SIRT3可能通過參與自噬過程,減少細胞凋亡。在早期,適度上調自噬在一定程度上可以減少細胞凋亡,發(fā)揮保護神經元的作用。第二部分研究發(fā)現(xiàn):(1)過表達SIRT3可明顯改善OGD/R處理后小鼠皮層神經元損傷形態(tài),增強神經元活性,減少細胞凋亡率;(2)蛋白免疫印跡和免疫熒光結果發(fā)現(xiàn),與OGD4h組比較,過表達SIRT3后OGD/R損傷小鼠神經元LC3-Ⅱ、PINK1表達增高(P0.05),Cleaved caspase-3表達下降(P0.05);進一步免疫熒光檢測結果印證了,SIRT3表達上調,LC3-Ⅱ點狀熒光增強,自噬增加,Caspase-3表達減少,細胞凋亡減少;(3)CCK-8檢測和Western blot檢測結果提示,通過3-MA抑制自噬和RAPA上調自噬表明,抑制自噬,過表達SIRT3神經元自噬顯著降低,細胞活性降低,損傷加重,凋亡減少;提高自噬,過表達SIRT3小鼠神經元自噬增強,細胞活性增高,凋亡減少。本部分研究表明:過表達SIRT3可明顯改善OGD/R處理后的神經元損傷,減少細胞凋亡,發(fā)揮神經元保護作用;抑制自噬,可以抵消SIRT3保護神經元作用,提高自噬,可以增加SIRT3對OGD/R損傷的拮抗作用。實驗結論本研究證實:OGD/R損傷可激活神經元自噬,OGD4h是自噬水平的最高峰。在4h以內,適度上調自噬在一定程度上可以減少細胞凋亡,發(fā)揮保護神經元的作用;過表達SIRT3小鼠皮層神經元抵抗OGD/R損傷能力提高,細胞活性增強;SIRT3可能通過調控自噬發(fā)生,抑制神經元凋亡,參與了拮抗神經元缺血損傷,發(fā)揮神經元保護作用。
【學位單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R743
【部分圖文】：

空軍軍醫(yī)大學碩士學位論文會導致細胞死亡；如 CBF 持續(xù)每分鐘低于 10ml/min 時，腦損傷不可逆現(xiàn)永久性梗死；如腦血流量減少至 5ml/min，僅 30min 即可出現(xiàn)梗死[4性腦卒中的病理變化前，缺血性腦卒中的具體分子機制并不明確，可能與：能量代謝障礙、性、鈣離子超載、和細胞炎性因子、氧自由基清除障礙等有關[6, 7]。從注后導致細胞損傷及死亡的信號通路中，我們可以看出，線粒體的能量因素，又是介導損傷的中心環(huán)節(jié)[7]（圖 1）。

圖 2 自噬分類（Noboru Mizushinma et al. Nature, 2008）體自噬體具有能量轉化、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、協(xié)同鈣離子等功能，氧化代謝，為細胞提供能量的場所。線粒體呼吸活動的副產物是超化氫和羥基自由基等活性氧的形成。ROS攻擊蛋白質、脂類和核酸鏈反應。目前認為，線粒體不僅為細胞提供能量，還參與了細胞的號傳導以及鈣穩(wěn)態(tài)調控等過程。目前研究已證實：細胞內成分，包物質和細胞器可以被特異性的被選擇消化降解，例如線粒體自噬、內質網自噬、核糖體自噬[71]。而作為自噬的形式之一，目前研究較噬，是細胞通過自噬機制特異性清除受損的線粒體的過程[72, 73]。 Du微鏡第一次在哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)線粒體自噬[74]。它是一種選擇性粒體有針對性自噬降解的形式，線粒體自噬清除線粒體功能失調和

-35-至7d左右，細胞形態(tài)呈不規(guī)則的梭形或類橢圓形，胞核清晰，核仁明顯，神經元突起較長，呈放射狀，相互聯(lián)系，形成復雜的網絡連接 (圖1A)。經氧糖剝奪處理2h后神經元貼壁能力下降，部分細胞腫脹，胞體折光性減小，突觸部分斷裂，網狀結構尚存(圖1B)；至OGD4h后神經元折光性降低，胞體、細胞核固縮，細胞間隙增大，包漿內可見空泡樣改變，突觸呈斷續(xù)串珠樣，網狀結構被破壞(圖1C) ；OGD8h后神經元碎片化，突觸膨脹斷裂，網狀結構幾乎消失，細胞之間失去網絡聯(lián)系(圖1D) 。圖 1： 經 OGD 損傷后的各組神經元的形態(tài)圖（×200）3.2 OGD/R 處理對小鼠皮層神經元損傷的影響經不同時長 OGD/R 處理后，CCK-8 檢測檢測結果顯示，隨著 OGD/R 損傷時間的延長，可造成細胞活性呈進展性下降趨勢，與正常對照組比較，各組間存在顯著統(tǒng)計學差異（圖 2）。
【參考文獻】

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1 陳璐勔;羅艷琳;趙麗;韓松;李淑娟;李俊發(fā);;細胞自噬緩解氧-糖剝奪誘導原代培養(yǎng)小鼠腦皮質神經元缺血損傷[J];基礎醫(yī)學與臨床;2014年12期

2 常明則;吳海琴;喬琳;王新來;狄政莉;劉志勤;毛佳;田曄;;腦缺血再灌注后大鼠運動皮質SIRT_3的表達特點[J];陜西醫(yī)學雜志;2014年05期

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本文編號：2852819