背景膠質瘤是中樞系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,嚴重危害人體健康。目前針對膠質瘤的治療雖然有一定的效果,但由于膠質瘤的侵襲性生長特性,與周圍腦組織分界不清,手術很難完全切除。然而由于膠質瘤耐受性等治療的局限性,放療和化療療效有限,尤其是高級別神經膠質瘤,復發(fā)率高,預后差,中位生存期不足一年。近年來分子水平的基因治療是膠質瘤治療和研究的新方向。通過抑制信號傳導通路的異常激活,進而調控細胞周期,可有效促進腫瘤細胞凋亡及抑制腫瘤細胞增殖。因此,深入研究膠質瘤的發(fā)生發(fā)展機制,找到針對膠質瘤的有效治療靶點,對于延長膠質瘤患者的生存期及提高生活質量有重要意義。Notch受體是一種Ⅰ型跨膜受體蛋白,在進化上高度保守,對細胞的生長、分化、增殖、凋亡起著不可替代的作用。在Notch受體結構中,共存在Notch1-4四種受體,它們的生物學功能是存在差別的,甚至截然相反。證據(jù)表明,Notch受體表達異常與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關。在中樞神經系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生中,Notch既可發(fā)揮促癌作用,又可發(fā)揮抑癌作用,這是由于Notch存在不同的同源受體。Notch 3基因被確認為哺乳動物的第三個缺口,最初被描述為在增殖的神經上皮中表達。國外有研究發(fā)現(xiàn),Notch3基因在膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡等方面發(fā)揮著癌基因的作用并具有預后判斷價值,可作為高級別膠質瘤基因治療的分子靶標,而國內有關Notch3受體在膠質瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及相關分子機制研究鮮見報道。目的為了探討Notch3信號通路在膠質瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,本研究首先檢測膠質瘤組織中Notch3 mRNA及蛋白的表達,以及Ki-67、Bcl-2、Caspase3蛋白的表達,分析Notch3與膠質瘤發(fā)生發(fā)展及增殖、凋亡的關系。其次通過檢測膠質瘤組織中IDH基因突變狀態(tài),分析Notch3與預后相關因子IDH的關系。最后通過Notch3受體抑制劑,抑制膠質母細胞瘤細胞株U87、U251中Notch3的表達,分析Notch3對腫瘤細胞增殖、侵襲、凋亡的影響。以期在分子水平上闡明Notch3在膠質瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用,為其臨床治療提供科學依據(jù)。方法(1)采用實時熒光定量PCR的方法檢測40例膠質瘤新鮮標本(彌漫性星形或少突膠質細胞腫瘤)和10例正常腦組織新鮮標本中Notch3 mRNA的表達情況。(2)采用免疫組織化學方法檢測80例膠質瘤組織(彌漫性星形或少突膠質細胞腫瘤)及49例膠質細胞增生組織中Notch3、Ki-67、Bcl-2及Caspase3蛋白的表達情況,分析Notch3與Ki-67、Bcl-2及Caspase3蛋白表達的關系。(3)采用基因測序的方法檢測80例膠質瘤組織(彌漫性星形或少突膠質細胞腫瘤)中IDH基因突變狀態(tài),分析Notch3蛋白表達與IDH基因突變的關系。(4)將不同劑量的Notch3受體抑制劑DAPT加入膠質母細胞瘤細胞株U87及U251中,運用實時熒光定量PCR及western blot方法檢測Notch3的抑制效果。根據(jù)抑制劑劑量及抑制效果將細胞分為三組:對照組、Notch3低表達1組(Low-1)、Notch3低表達2組(Low-2)。(5)Notch3受體抑制后,采用CCK-8細胞增殖實驗檢測U87及U251細胞對照組、Low-1組、Low-2組增殖能力的變化,運用分光光度儀檢測細胞在450nm波長的吸光度。(6)Notch3受體抑制后,采用Transwell侵襲小室實驗檢測U87及U251細胞對照組、Low-1組、Low-2組侵襲能力的變化,倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變。(7)Notch3受體抑制后,采用AnnexinV-FITC/PI方法檢測U87及U251細胞對照組、Low-1組、Low-2組凋亡能力的變化,在熒光顯微鏡下觀察細胞的變化。結果(1)40例膠質瘤新鮮組織中,Notch3 mRNA的表達水平為2.26士1.60,明顯高于正常腦組織(0.95士0.69,P0.05)。(2)80例膠質瘤組織中,Notch3蛋白陽性表達率(55.00%)明顯高于膠質細胞增生組織(36.70%,P0.01);在≥60歲患者中的陽性表達率(75.00%)明顯高于60歲患者(48.33%,P0.05);與膠質瘤組織學分級(ⅡvsⅢvsⅣ:31.81%、55.00%、68.42%)呈正相關(P0.05);而與患者的性別無關(P0.05)。(3)80例膠質瘤組織中,Ki-67蛋白陽性表達率(63.75%)明顯高于膠質細胞增生組織(14.28%,P0.01);與膠質瘤組織學分級(ⅡvsⅢvsⅣ:27.27%、60%、86.84%)呈正相關(P0.05);而與患者的年齡、性別無關(P0.05)。(4)80例膠質瘤組織中,Bcl-2蛋白陽性表達率(58.75%)明顯高于膠質細胞增生組織(46.90%,P0.01);與膠質瘤組織學分級(ⅡvsⅢvsⅣ:31.81%、60.00%、73.68%)呈正相關(P0.05);而與患者的年齡、性別無關(P0.05)。(5)80例膠質瘤組織中,Caspase3蛋白陽性表達率(38.75%)明顯低于膠質細胞增生組織(57.29%,P0.01);與膠質瘤組織學分級(ⅡvsⅢvsⅣ:68.18%、30.00%、26.31%)呈負相關(P0.05);而與患者的年齡、性別無關(P0.05)。(6)膠質瘤組織中,Notch3蛋白表達與Ki-67呈正相關(r=0.347,P0.01),與Bcl-2呈正相關(r=0.272,P0.01),而與Caspase3呈負相關(r=-0.315,P0.01)。(7)80例膠質瘤組織中,IDH基因突變率為36.25%;在60歲患者中的突變率(45.00%)明顯高于≥60歲患者中的突變(10.00%,P0.05);與膠質瘤組織學分級(ⅡvsⅢvsⅣ:63.63%、45.00%、15.78%)呈負相關(P0.05);而與患者的性別無關(P0.05);膠質瘤組織中,IDH基因突變與Notch3蛋白表達呈負相關(P0.01)。(8)Notch3受體抑制劑DAPT加入U87、U251細胞后,與對照組相比,Low-1組、Low-2組Notch3 mRNA(U87:1.00士0.00 VS 0.45士0.07 VS 0.22士0.05;U251:1.00士0.00 VS 0.52士0.15 VS 0.19士0.08)及Notch3蛋白(U87:0.83士0.06 VS 0.61士0.09 VS 0.36士0.07;U251:0.85士0.08 VS 0.57士0.03VS 0.31士0.04)表達明顯下調(P0.05)。(9)Notch3受體抑制劑DAPT加入U87、U251細胞后,與對照組相比,Low-1組、Low-2組細胞增殖能力(U87:1.70士0.03 VS 1.37士0.07 VS 0.99士0.11;U251:1.51士0.05 VS 1.30士0.05 VS 0.89士0.10)明顯減弱(P0.05)。(10)Notch3受體抑制劑DAPT加入U87、U251細胞后,與對照組相比,Low-1組、Low-2組細胞侵襲能力(U87:75.00士11.53 VS 33.50士6.28 VS 14.67士2.08;U251:61.50士10.69 VS 32.33士6.51 VS 12.00士3.61)明顯減弱(P0.05)。(11)Notch3受體抑制劑DAPT加入U87、U251細胞后,與對照組相比,Low-1組、Low-2組細胞凋亡率(U87:8.80士3.03 VS 22.40士3.05 VS 47.00士4.64;U251:6.60士3.36 VS 20.20士4.21 VS 42.40士5.86)明顯升高(P0.05)。結論(1)Notch3基因在膠質瘤組織中過度表達,而在正常組織中不/低表達,提示Notch3激活表達與膠質瘤的發(fā)生發(fā)展有關。(2)膠質瘤組織中,Notch3蛋白表達與Ki-67、Bcl-2呈正相關,而與Caspase3、IDH呈負相關,提示Notch3表達可能與膠質瘤的增殖、凋亡及預后相關。(3)膠質瘤細胞中,下調Notch3表達,可抑制細胞增殖、侵襲,促進細胞凋亡,提示Notch3與膠質瘤細胞的增殖、侵襲、凋亡相關。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R739.4
【部分圖文】：

果Notch3 mRNA 在膠質瘤組織和相對正常腦組織中的表達探究 Notch3 在膠質瘤中的表達水平，我們首先在 mRNA 水平比較了腦膠質瘤組織與相對正常腦組織的表達差異性。采用 qRT-PCR 方法質瘤組織新鮮標本和 10 例相對正常腦組織新鮮標本。結果顯示：膠 Notch3 mRNA 的表達水平為 2.26 士 1.60，明顯高于相對正常腦組織（，P<0.05）（圖 1）。

胞漿和細胞膜，棕黃色或淺黃色（圖 2.1 A）；80 例腦膠質瘤組織中有 46 例陽性表達，陽性率 55.00 %。在相對正常腦組織中，Notch3 蛋白的陽性表達著于細胞漿和細胞膜，淺黃色（圖 2.1 B）；49 例中有 18 例呈陽性表達，陽性36.70 %。二者相比，Notch3 蛋白在人腦膠質瘤組織中的表達明顯高于相對正腦組織。差異有統(tǒng)計學意義（χ2= 23.051，P<0.05，表 2.1）。A B

圖 3.1 Ki-67 蛋白在膠質瘤組織和相對正常腦組織中的表達A：瘤組織（200×）；B：相對正常組織（200×）表 3.1 Ki-67 蛋白在膠質瘤組織和相對正常腦組織中的表達部位 例數(shù)Ki-67χ2P－ +正常 49 42 7 30.045 0.0膠質瘤 80 29 514.3.2 Ki-67 蛋白在腦膠質瘤組織中的表達與臨床病理參數(shù)的關系80 例腦膠質瘤組織中，男性 45 例，女性 35 例，Ki-67 蛋白在男性患者中陽性率為（53.33 %，24 / 45），在女性患者中的陽性率為（77.14 %，27 / 35）二者相比，差異無統(tǒng)計學意義（χ2= 0.830，P>0.05，表 3.2）。80 例腦膠質瘤組織中，年齡≥60 歲共 20 例，年齡<60 歲共 60 例。Ki-67 白在<60 歲患者中的陽性率為（63.33 %，38 / 60），在≥60 歲患者中的陽性率
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本文編號：2844157