研究目的:1、探討谷氨酸興奮毒性損傷對PPARγ表達的影響及其可能的調(diào)節(jié)機制;2、通過谷氨酸損傷后PPARγ磷酸化修飾的變化,探討谷氨酸損傷后PPARγ的活性改變及其可能機制。3、觀察PPARγ激動劑羅格列酮(Rosiglitazone)、吡格列酮(Pioglitazone)和MAPK/ERK1/2抑制劑U0126對谷氨酸興奮毒性損傷的影響,進一步探討激活PPARγ或保護其活性對谷氨酸興奮毒性損傷的保護作用。實驗方法:以成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠作為實驗動物,進行試驗。1、SD大鼠隨機分為正常組、對照組、谷氨酸組、NMDA組,其中正常組為正常大鼠不予以任何處理,對照組為予以相同體積的安慰劑皮層注射,谷氨酸組及NMDA組予以不同濃度及不同時間處理,其中不同濃度處理組分別予以濃度為50、100、200 mmol/L的谷氨酸或NMDA各1μL皮層注射;不同時間處理組為注射200mmol/L谷氨酸或NMDA分別作用3、6、12、24h后處死。(1)Western blot法檢測谷氨酸或NMDA損傷后各組炎癥、凋亡相關蛋白COX-2、iNOS、cleaved caspase-3的表達變化。(2)免疫熒光染色法進行炎癥、凋亡相關蛋白染色,觀察損傷后COX-2、iNOS、cleaved caspase-3信號強度的變化和細胞定位。(3)通過HE、TTC染色檢測谷氨酸或NMDA損傷后的組織學改變。2、SD大鼠隨機分為對照組、MK-801單獨處理組、谷氨酸組、MK-801處理組,其中對照組為予以相同體積的安慰劑(生理鹽水)皮層注射,MK-801單獨處理組只給予0.15mg/kg MK-801腹腔注射,谷氨酸組為200 mmol/L谷氨酸1μL皮層注射,MK-801處理組為在谷氨酸處理的基礎上,提前30min予以0.375、0.75、0.15mg/kg MK-801腹腔注射,動物24h后處死。(1)Western blot法檢測MK-801對谷氨酸引起的炎癥、凋亡相關蛋白COX-2、iNOS、cleaved caspase-3表達變化。(2)HE染色法檢測MK-801對谷氨酸損傷后組織學改變的影響。3、SD大鼠隨機分為正常組、對照組、谷氨酸或NMDA組,處理方式同前。(1)Western blot法檢測谷氨酸損傷對PPARγ、pPPARγ、ERK1/2、pERK1/2表達的影響。(2)免疫熒光染色法進行PPARγ與NeuN雙染,觀察谷氨酸損傷后PPARγ表達變化及細胞定位。4、SD大鼠隨機分為對照組、干預劑單獨處理組、谷氨酸或NMDA組、干預劑組。干預劑分別為MK-801腹腔注射、GSH鼠尾靜脈注射、BAPTA-AM、Calpeptin、Ac-DEVD-CHO皮層微量注射。對照組、谷氨酸或NMDA組處理同前,干預劑單獨處理組為只給予干預劑處理,干預劑組為在谷氨酸或NMDA(200mmol/L)處理的基礎上,提前30min予以各干預劑處理。Western blot法檢測各組PPARγ表達。5、SD大鼠隨機分為對照組、U0126單獨處理組、谷氨酸或NMDA組、U0126組。對照組、谷氨酸或NMDA組,處理方式同前。U0126單獨處理組為只給與U0126處理。U0126組為在谷氨酸或NMDA(200 mmol/L)的基礎上,提前30min予以U0126處理。Western blot法檢測ERK1/2激活抑制劑U0126對谷氨酸或NMDA引起的pPPARγ、ERK1/2、pERK1/2表達的影響。6、SD大鼠隨機分為正常組、對照組、保護劑單獨處理組、NMDA組、保護劑組。保護劑為Ros、Pio腹腔注射或U0126皮層注射。其中正常組、對照組、NMDA組處理同前,保護劑單獨處理組為只給予保護劑處理,保護劑組為在NMDA(200 mmol/L)的基礎上,提前30min予以保護劑處理。(1)HE、TTC染色法評價各保護劑對NMDA損傷的保護作用。(2)Western blot法檢測各組炎癥、凋亡相關蛋白表達變化。(3)免疫熒光染色法進行炎癥、凋亡相關蛋白與NeuN雙染,觀察保護劑對谷氨酸損傷后的保護作用及細胞定位。實驗結果:1、谷氨酸興奮毒性損傷模型評價:(1)Western blot法檢測顯示,谷氨酸或NMDA引起COX-2、iNOS、cleaved caspase-3蛋白表達增加,而MK-801可抑制谷氨酸引起的上述蛋白表達增加(P0.05,差異具有統(tǒng)計學意義)。(2)免疫熒光染色結果顯示,與對照組相比,谷氨酸或NMDA組COX-2、iNOS、cleaved caspase-3蛋白信號強度增強(P0.05)。(3)HE染色顯示谷氨酸或NMDA處理引起的皮層損傷,且這種損傷可被MK-801抑制,提示谷氨酸興奮毒性損傷主要通過NMDA受體介導。2、谷氨酸對PPARγ的調(diào)節(jié)作用:(1)谷氨酸處理:1)Western blot法檢測顯示,與對照組相比,PPARγ表達呈時間及劑量依賴性增加(P0.05,差異具有統(tǒng)計學意義)。2)免疫熒光染色法顯示,與對照組相比,PPARγ蛋白信號強度增強,且大部分可與NeuN信號疊加,提示主要表達于神經(jīng)元細胞中。(2)NMDA處理:Western blot法檢測顯示,與對照組相比,PPARγ表達呈時間及劑量依賴性增加(P0.05,差異具有統(tǒng)計學意義),與谷氨酸作用一致。(3)MK-801處理:Western blot法檢測顯示,MK-801可明顯抑制谷氨酸引起的PPARγ表達增加,作用具有劑量依賴性,提示谷氨酸對PPARγ的作用主要通過NMDA受體介導。(4)其它處理:Western blot法檢測顯示,與NMDA組比較,隨著GSH、BAPTA-AM、Calpeptin、Ac-DEVD-CHO提前給予,NMDA引起的PPARγ表達增加被抑制(P0.05,差異具有統(tǒng)計學意義),提示谷氨酸對PPARγ的作用與氧化應激、鈣離子-calpain-caspase 3信號途徑有關。3、谷氨酸對PPARγ活性的調(diào)節(jié)作用:(1)p-PPARγ表達:Western blot法檢測顯示,NMDA處理3-24h引起p-PPARγ表達呈時間依賴性增加。(2)PPARγ表達:Western blot法檢測顯示,NMDA處理3、6 h PPARγ無明顯改變,12、24h PPARγ表達明顯增加。(3)p-PPARγ/PPARγ比值:NMDA處理引起比值呈雙相性改變,3-6h增加,12-24h下降(即恢復),提示NMDA通過誘導PPARγ磷酸化可引起PPARγ活性一過性抑制。(2)p-ERK1/2表達:Western blot法檢測顯示,NMDA引起p-ERK1/2表達增加,作用呈時間及劑量依賴性(P0.05,差異具有統(tǒng)計學意義),總ERK1/2無變化。(3 ERK1/2抑制劑U0126的作用:U0126可抑制NMDA引起p-ERK1/2、p-PPARγ表達增加,提示NMDA可通過激活ERK1/2引起PPARγ磷酸化。4、保護劑Ros、Pio、U0126對谷氨酸興奮毒性保護作用:(1)HE染色及TTC染色可見,與NMDA組相比,保護劑組損傷體積較NMDA組損傷體積明顯減小。(2)Western blot法檢測顯示,保護劑Ros、Pio、U0126可明顯抑制NMDA引起的COX-2、iNOS、cleaved caspase-3蛋白表達增加(P0.05,差異具有統(tǒng)計學意義)。提示激活PPARγ或保護其活性對谷氨酸興奮毒性損傷具有保護作用。實驗結論:1、谷氨酸主要通過NMDA受體產(chǎn)生興奮毒性損傷作用2、谷氨酸損傷引起神經(jīng)元PPARγ的表達增加,該作用可能為NMDA受體依賴的、鈣離子-calpain-caspase-3介導的、與氧化應激有關的一種神經(jīng)元自我保護性反應。3、谷氨酸興奮毒性損傷早期通過增加PPARγ磷酸化修飾而引起一過性PPARγ活性抑制,該作用可能與谷氨酸激活MAPK/ERK1/2通路有關。4、PPARγ激動劑(Ros、Pio)及ERK1/2激活抑制劑(U0126)對谷氨酸興奮毒性具有保護作用,其作用機制可能通過激活PPARγ或保護其活性,產(chǎn)生直接或間接的抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用有關。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R741
【部分圖文】：

天津醫(yī)科大學碩士學位論文 度及不同時間組分別與對照組相比用單因素方差分析；U0126 處理組與正常組比較用獨立樣本 t 檢驗，NMDA 組 與 U0126 不同濃間的比較用單因素方差分析。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。果氨酸興奮毒性損傷評價1 大鼠大腦皮層微量注射預實驗實驗大鼠固定于立體定位儀上，予以亞甲藍染料 2μl 大腦皮層注射分布如圖所示（圖 1.1），注射的染料絕大部分部位位于單側左側大

圖 1.3 谷氨酸損傷對炎癥、凋亡蛋白 COX-2、iNOS、cleaved caspase-3 表達的影響(免疫熒光染色，×400)（3）腦組織 HE 染色HE 染色顯示（圖 1.4），與對照組相比，給予谷氨酸（200 mmol/L）處理 24h 后，低倍鏡（×10）下可見皮層有明顯損傷灶（淺色區(qū)域），高倍鏡（×200）下可見核固縮，胞質(zhì)濃縮，細胞體積減小，細胞排列紊亂等改變。

圖 1.3 谷氨酸損傷對炎癥、凋亡蛋白 COX-2、iNOS、cleav影響(免疫熒光染色，×400)（3）腦組織 HE 染色HE 染色顯示（圖 1.4），與對照組相比，給予谷氨酸（2h 后，低倍鏡（×10）下可見皮層有明顯損傷灶（淺色區(qū)域）下可見核固縮，胞質(zhì)濃縮，細胞體積減小，細胞排列紊亂等
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本文編號：2838408