研究背景膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma, GBM)在成人中是最常見(jiàn)的腦原發(fā)性惡性腫瘤,其確診后的中位生存期僅為14個(gè)月。化學(xué)藥物治療(化療)作為腫瘤輔助治療的方式之一,能有效殺滅腫瘤細(xì)胞,抑制腫瘤生長(zhǎng)及遷移,延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。然而,GBM極易出現(xiàn)化療耐藥現(xiàn)象而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā),治療失敗。因此,GBM的化療耐藥性已成為近年來(lái)膠質(zhì)瘤臨床治療急需解決的重要問(wèn)題之一。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性,丟失細(xì)胞間緊密連接和粘附連接,在形態(tài)學(xué)上發(fā)生向間質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變,并獲得更強(qiáng)的遷移、侵襲、增殖以及抗凋亡能力的過(guò)程。在EMT過(guò)程中,腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶,侵入細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜,向遠(yuǎn)處器官發(fā)生轉(zhuǎn)移,形成新的腫瘤病灶。有研究發(fā)現(xiàn)EMT與腫瘤化療耐藥密切相關(guān)。由此,探尋EMT與化療耐藥之間相關(guān)性的分子機(jī)制,對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤治療策略意義重大。通過(guò)人基因表達(dá)譜芯片對(duì)膠質(zhì)瘤耐甲磺酸伊馬替尼細(xì)胞株U87AR和非耐藥細(xì)胞株U87中21325個(gè)基因進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)U87AR細(xì)胞中包含鋅指轉(zhuǎn)錄因子(SNAI2)在內(nèi)的1050個(gè)基因表達(dá)上調(diào),1120個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。并且,免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SNAI2在化療后復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)較原發(fā)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)增高。鋅指轉(zhuǎn)錄因子SNAI2 (又稱slug)是Snail超家族成員之一,通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子上的E-box結(jié)合抑制蛋白轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)EMT,使腫瘤細(xì)胞變得具有遷移性和侵襲性。最近的研究表明,SNAI2的異常表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲、凋亡及血管生成等方面的調(diào)控,與腫瘤惡性程度密切相關(guān)。然而,SNAI2在膠質(zhì)瘤耐藥性中的作用目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)研究。微小RNA (microRNAs,miRNAs)是真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類非編碼RNA,作為重要的調(diào)控因子,其參與多種細(xì)胞的生物進(jìn)程。MiRNAs與靶基因3'非編碼區(qū)(3'-UTR)結(jié)合,主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制或降解轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因蛋白的表達(dá)。MiRNAs在多種正常組織與腫瘤組織中的差異表達(dá)譜,表明miRNAs在腫瘤的分類和療效預(yù)測(cè)中具有重要的意義。越來(lái)越多的研究表明miRNA在腫瘤細(xì)胞化療耐藥和EMT的過(guò)程中扮演著十分重要的角色。比如,在膀胱癌細(xì)胞中,miR-27a通過(guò)靶向作用于SLC7A11基因,逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。無(wú)獨(dú)有偶,在人源小細(xì)胞肺癌中,miR-135a通過(guò)靶向作用于APC基因,調(diào)控癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的藥物敏感性。而且,最近的一項(xiàng)研究表明,在乳腺癌和肺腺癌細(xì)胞中miR-200家族參與調(diào)控由TGF-p及EMT誘導(dǎo)因子引發(fā)的EMT效應(yīng)。盡管如此,miRNAs以及它們的靶基因在EMT過(guò)程中如何參與化療耐藥的調(diào)控,目前具體機(jī)制尚未清楚。我們前期采用miRNA芯片對(duì)比分析膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞U87AR和非耐藥細(xì)胞U87之間miRNAs的表達(dá)譜差異性發(fā)現(xiàn)：miR-203在膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞株U87AR中的表達(dá)較敏感細(xì)胞株U87中降低。然而,關(guān)于miR-203在膠質(zhì)瘤化療耐藥中的作用及其分子機(jī)制,目前尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。另外,cDNA基因芯片對(duì)比耐藥細(xì)胞株U87AR和親本細(xì)胞U87發(fā)現(xiàn)：EMT主要間質(zhì)標(biāo)記物(SNAI2、ZEB1和vimentin)在U87AR中的表達(dá)明顯高于U87親本細(xì)胞。生物信息學(xué)分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SNAI2可能是miR-203的潛在靶基因。綜上所述,我們推測(cè)EMT可能在SNAI2的調(diào)控下參與了膠質(zhì)瘤耐藥機(jī)制的過(guò)程。本課題的研究目的為探討SNAI2在miR-203的調(diào)控下,可通過(guò)誘導(dǎo)EMT,參與膠質(zhì)瘤耐藥機(jī)制的調(diào)節(jié)。通過(guò)本項(xiàng)目研究,進(jìn)一步豐富膠質(zhì)瘤耐藥的分子機(jī)制,為膠質(zhì)瘤耐藥的研究提供依據(jù),為解決臨床棘手的膠質(zhì)瘤耐藥問(wèn)題提供一種新的治療策略。材料和方法1.臨床標(biāo)本收集收集2010年12月至2013年10月間在南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院、珠江醫(yī)院以及三九腦科醫(yī)院接受治療的80例膠質(zhì)瘤病人的臨床資料及腫瘤組織標(biāo)本。其中Ⅰ級(jí)星形細(xì)胞瘤9例,Ⅱ級(jí)星形細(xì)胞瘤13例,Ⅲ級(jí)星形細(xì)胞瘤7例和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤51例。而在51例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人中,16例為替莫唑胺化療半年后腫瘤復(fù)發(fā)病例。組織標(biāo)本手術(shù)切除后立即冰凍保存,并由病理科行病理學(xué)檢查確診。所有確診后的膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本放-80℃保存,部分行石蠟包埋供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。本研究經(jīng)珠江醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并在其監(jiān)督下收集病人相關(guān)資料,所有患者簽署知情同意書。2.細(xì)胞培養(yǎng)人源膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251和U87均從南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院獲取。耐甲磺酸伊馬替尼(Imatinib)細(xì)胞株U251AR和U87AR前期已成功構(gòu)建并保存于南方醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。采用含10%胎牛血清和20%青霉素/鏈霉素(雙抗)的DMEM培養(yǎng)基,在37℃、5%二氧化碳以及飽和濕度的條件下傳代培養(yǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。為了維持細(xì)胞的多藥耐藥表型,U251AR和U87AR交替使用無(wú)藥培養(yǎng)基和含甲磺酸伊馬替尼(濃度為122 μg/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前耐藥細(xì)胞株至少在不含伊馬替尼的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周。3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。濃度均為100 nmol/L的miR-203模擬物(mimics)、拮抗劑(anti-miR-203)和陰性對(duì)照組,以及濃度均為60 nmol/L的SNAI2特異性短發(fā)夾干擾片段和陰性對(duì)照組,通過(guò)與Lipofectamine 2000及OPTI-MEMI混合后轉(zhuǎn)染細(xì)胞。具體操作按LipofectamineTM 2000試劑說(shuō)明書進(jìn)行。而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染則采用LipofectamineTM 2000將表達(dá)SNAI2的SNAI2-eGFP-N1-1載體及其空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入膠質(zhì)瘤細(xì)胞,通過(guò)濃度為500μg/mL的G418篩選陽(yáng)性克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),獲得穩(wěn)定表達(dá)SNAI2的細(xì)胞株。篩出的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后,可用于后續(xù)基因表達(dá)及功能試驗(yàn)研究。用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的RNA寡核糖核苷酸片段購(gòu)自上海吉瑪公司,其序列如下所示：RNA oligoribonucleotides SequencemiR-203 mimic 5'-GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG-3' 5'-AGUGGUCCUAAACAUUUCACUU-3'miR-203 mimic NC 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3' 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'miR-203 inhibitor 5'-CUAGUGGUCCUAAACAUUUCAC-3'miR-203 inhibitor NC 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3'4. MiRNA基因芯片分析基因芯片在耐藥細(xì)胞株U87AR和親本細(xì)胞株U87中進(jìn)行miRNAs表達(dá)譜分析。具體操作如下：按照說(shuō)明書采用TRIzol (Invitrogen)和RNeasy mini kit (Qiagen)試劑盒抽提細(xì)胞總RNA。然后用miRCURYTM Hy3TM/Hy5TM Power labeling kit (Exiqon)試劑標(biāo)記樣品,并放置于miRCURY LNA Array (Exiqon, version 11.0)進(jìn)行雜交。而后在Axon GenePix 4000B掃描儀上進(jìn)行掃描,并使用GenePix pro version 6.0讀取信號(hào)強(qiáng)度值。最后我們選取耐藥細(xì)胞U87AR和親本細(xì)胞U87之間表達(dá)差異倍數(shù)在1.5倍以上的miRNAs作為后續(xù)研究對(duì)象.5.總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR按照試劑說(shuō)明書,總RNA通過(guò)TRIzol (Invitrogen)提取并分離。取上述RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。miR-203表達(dá)水平的檢測(cè)采用miRNAsqPCR Quantitation Kit試劑盒(吉瑪公司),以及加入miRNAs特異性的反轉(zhuǎn)錄序列和內(nèi)參U6等嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明操作。按實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試劑盒說(shuō)明(TAKARA)檢測(cè)SNAI2、ZEB1、E-cadherin和vimentin的mRNA表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用SYBR Green作標(biāo)記,并在ABI7500儀器上運(yùn)行。選取GAPDH或U6作為內(nèi)參,三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式RQ=2-△△ct的方法進(jìn)行分析。由TAKARA公司設(shè)計(jì)合成引物序列如下所示：Gene Primer sequencesSNAI2 Forward:5'-TGGTTGCTTCAAGGACACAT-3' Reverse:5'-GTTGCAGTGAGGGCAAGAA-3'ZEB1 Forward:5'-GGGAGGAGCAGTGAAAGAGA-3' Reverse:5'-TTTCTTGCCCTTCCTTTCTG-3'E-cadherin Forward:5'-CCCGGGACAACGTTTATTAC-3' Reverse:5'-GCTGGCTCAAGTCAAAGTCC-3'Vimentin Forward:5'-CCCTCACCTGTGAAGTGGAT-3' Reverse:5'-TCCAGCAGCTTCCTGTAGGT-3'GAPDH Forward:5'-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3' Reverse:5'-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3'miR-203 Order from GenePharma:Lot No.91126N22U6 Order from GenePharma:Lot No.83008710426.免疫印跡(Western blot)檢測(cè)蛋白表達(dá)提取細(xì)胞總蛋白,采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定,再經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離,用半干法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。然后,5%脫脂奶封閉1.5h,TBST洗膜后用相應(yīng)的SNAI2、ZEB1、E-cadherin和vimentin單克隆抗體(Cell Signaling Technology) 4 ℃孵育過(guò)夜,洗膜后分別加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1：5000),常溫下孵育2h,再洗膜后行ECL化學(xué)發(fā)光顯影。GAPDH作內(nèi)參使用,蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度采用Quantity One軟件進(jìn)行定量。7.雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)將miR-203位于SNAI2的3'非編碼區(qū)的反應(yīng)元件(野生型或突變型),克隆至熒光素酶報(bào)告基因下游的psiCheck2質(zhì)粒。然后利用luciferase assay kit試劑盒(Promega)和GloMaxTM 96 Microplate Luminometer發(fā)光檢測(cè)儀分別測(cè)定Firefly luciferase和Renilla luciferase活性。再以兩者間活性的比值作為熒光素酶的相對(duì)活性,進(jìn)行不同樣品間的比較。8.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用胰酶進(jìn)行消化并吹勻成單細(xì)胞懸液。在鋪好Matrigel膠的Tanswell上室中加入200μl細(xì)胞懸液(總的細(xì)胞數(shù)量為1×105),下室每室加600μ1含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,37℃溫度及含5%二氧化碳的孵箱培養(yǎng)48小時(shí)。隨后取出Tanswell上室,用PBS清洗,棉簽輕輕擦去膜上室面的膠,4%多聚甲醛室溫固定15分鐘,PBS再清洗3次,每次5分鐘,結(jié)晶紫染膜15分鐘,PBS清洗干凈,用刀片將膜從小室中剝離出來(lái),將膜下室面朝上置于載玻片上,200倍視野下顯微鏡進(jìn)行拍照。所有實(shí)驗(yàn)需重復(fù)3次以上。9.細(xì)胞劃痕及流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)以5×105/cm2的細(xì)胞密度接種于六孔板,置入37℃C孵箱培養(yǎng)12小時(shí),使細(xì)胞散開(kāi)生長(zhǎng)至完全接觸。更換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí),讓細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)。然后,在鋪開(kāi)的單層細(xì)胞上使用200μ1的槍頭輕輕劃一道痕,并用PBS洗凈。加無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),隨后用NIH Image J軟件測(cè)量各個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)痕道的寬度。每次實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)4次以上。流式細(xì)胞凋亡檢測(cè),采用Annexin V/Propidium Iodide Detection Kit試劑盒(KeyGEN),嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明操作。10.CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞藥物敏感性以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24小時(shí),然后加入不同濃度(50至200 μg/mL)的甲磺酸伊馬替尼(Imatinib)、依托泊苷(VP-16)和替莫唑胺(TMZ)3種化療藥物。常規(guī)培養(yǎng)48小時(shí)后,每孔加入新配制的CCK-8溶液10μl,置入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后終止培養(yǎng)。震蕩1分鐘后,在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選取450nm波長(zhǎng),測(cè)定各孔光吸收值。取每5個(gè)重復(fù)孔的光吸收值(A值)的平均值,計(jì)算各種轉(zhuǎn)染細(xì)胞在不同濃度的3種化療藥物下的存活率；細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值)/(陰性對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值)×100%。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,取平均值,分別計(jì)算出3種化療藥物的IC50值。細(xì)胞增殖活性分析：細(xì)胞懸液終體積為100μl,細(xì)胞數(shù)2×103每孔,接種于96孔板。用加了替莫唑胺的培養(yǎng)基(50 μg/mL)分別培養(yǎng)細(xì)胞24、48、72、96和120個(gè)小時(shí)。隨后按照試劑說(shuō)明書采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)活性。11.免疫熒光免疫熒光實(shí)驗(yàn)按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。簡(jiǎn)而言之,細(xì)胞用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定,0.5%的Triton X-100通透細(xì)胞膜以及10%的羊血清進(jìn)行封閉。細(xì)胞孵育相應(yīng)一抗后40C過(guò)夜,PBS洗3次,每次5分鐘,繼續(xù)孵育帶有熒光的二抗1小時(shí),再次PBS洗3次,每次5分鐘,用DAPI染核15分鐘后,PBS清洗3次,每次5分鐘。最后將細(xì)胞放置于倒置熒光顯微鏡下觀察或拍照。12.免疫組織化學(xué)將膠質(zhì)瘤組織進(jìn)行石蠟包埋,切片后固定于載玻片上。隨后石蠟切片進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶及血清封閉。SNAI2和E-cadherin的特異性單克隆抗體孵育濃度為1：200,4℃孵育過(guò)夜。每張玻片滴加帶有生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1：500),室溫孵育1小時(shí),PBS洗3次,每次5分鐘。每張玻片滴加新配制的DAB溶液,顯微鏡下觀察或拍照。最后,使用中性樹(shù)膠封片保存。結(jié)果判定：SNAI2和E-cadherin陽(yáng)性染色時(shí)呈棕黃色。13.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有結(jié)果均經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行分析處理。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫印跡、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)多組間的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析。方差齊,進(jìn)一步的多重比較采用LSD法；方差不齊則采用Dunnettn's T3法。臨床膠質(zhì)瘤標(biāo)本組間miR-203表達(dá)水平的比較采用Mann-Whitney test統(tǒng)計(jì)分析方法。SNAI2和miR-203表達(dá)水平的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。MiR-203表達(dá)水平與病人生存率的關(guān)系采用Log rank法分析。所有實(shí)驗(yàn)P值小于0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.耐甲磺酸伊馬替尼的膠質(zhì)瘤細(xì)胞與EMT的關(guān)系1.1前期已成功構(gòu)建的耐甲磺酸伊馬替尼的膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251AR和U87AR)對(duì)依托泊苷(VP-16)和替莫唑胺(TMZ)具有交叉耐藥的特性。在形態(tài)學(xué)方面,U251AR和U87AR細(xì)胞失去細(xì)胞極性,丟失細(xì)胞間緊密連接和黏附連接,呈松散的長(zhǎng)梭形間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。通過(guò)qRT-PCR和Western blot分別從mRNA和蛋白水平檢測(cè)EMT主要上皮標(biāo)志物(E-cadherin)和間質(zhì)標(biāo)志物(ZEB1、Vimentin)在耐藥細(xì)胞株及其相應(yīng)親本細(xì)胞中的差異表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)：E-cadherin. ZEB1和Vimentin在U251AR中的表達(dá)與U251中：(1)mRNA的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=28.238, P0.001)、(t=-4.799, P=0.003)、(t=-9.906, P0.001),表達(dá)量分別是U251中的(0.13±0.04)、(3.71±0.41)、(2.15±0.37)倍。(2)蛋白水平的表達(dá)差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=27.678, P0.001)、(t=-14.030, P0.001). (t=-19.856, P0.001),表達(dá)量分別是U251中的(0.19±0.02)、(6.11±0.53)、(2.80±0.33)倍。同樣,在U87AR及其親本細(xì)胞U87中檢測(cè)上述各基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果提示：E-cadherin、ZEB1和Vimentin在U87AR中的表達(dá)與U87中：(1) mRNA的表達(dá)差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.003, P0.001)、(t=-52.019, P0.001)、(t=-11.662, P0.001),表達(dá)量分別是U87中的(0.30±0.02)、(5.96±0.53)、(2.13±0.29)倍。(2)蛋白水平的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=61.417, P0.001)、(t=-114.311, P0.001)、(t=-80.766, P0.001),表達(dá)量分別是U87中的(0.31±0.03)、(6.26±0.44)、(2.31±0.28)倍。這與前期的基因表達(dá)譜芯片結(jié)果一致,從而表明U251AR和U87AR細(xì)胞發(fā)生了EMT的轉(zhuǎn)變。1.2細(xì)胞transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,耐藥細(xì)胞株U251AR和U87AR的侵襲能力較相應(yīng)的敏感株U251和U87顯著增強(qiáng)(t=-18.417, P0.001; t=-11.669, P0.001),。通過(guò)CCK-8法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力,我們發(fā)現(xiàn)U251AR細(xì)胞在48,72,96和120小時(shí)的增殖能力均高于U251細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-6.132, P=0.004;t=-12.463, P0.001;t=-6.379, P=0.003; t=-5.033, P=0.007);U87AR細(xì)胞在48,72,96和120小時(shí)的增殖能力均高于U87細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.885, P=0.045;t=-9.175, P=0.001;t=-6.390, P=0.003; t=-20.310, P0.001)。2.MiR-203參與調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT和化療耐藥性2.1我們前期通過(guò)miRNA基因芯片高通量篩選了膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞U87AR和非耐藥細(xì)胞U87之間miRNAs的差異表達(dá)譜,并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證篩選得到的差異表達(dá)基因。MiRNA芯片分析結(jié)果顯示,相對(duì)于親本細(xì)胞U87,14個(gè)miRNAs在耐藥細(xì)胞U87AR中表達(dá)顯著上調(diào),而包括miR-203在內(nèi)的11個(gè)miRNAs表達(dá)顯著下調(diào)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR提示miR-203在U87AR細(xì)胞中的表達(dá)較U87細(xì)胞下調(diào)5.80倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.439,P=0.001),進(jìn)一步驗(yàn)證了芯片的結(jié)果。2.2我們將miR-203模擬物(mimics)和抑制劑(antagomir-203)轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞,分別上調(diào)和下調(diào)細(xì)胞中miR-203的表達(dá)水平,觀察miR-203對(duì)細(xì)胞藥物敏感性的影響。結(jié)果提示：與對(duì)照組相比較,轉(zhuǎn)染了miR-203的U251AR細(xì)胞對(duì)三種化療藥物(Imatinib、VP-16和TMZ)的敏感性增加,半抑制濃度(IC50值)顯著降低(P0.001,P0.001,P0.001)；轉(zhuǎn)染了miR-203的U87AR細(xì)胞對(duì)Imatinib、VP-16和TMZ的敏感性亦增加,IC50值顯著降低(P0.001,P0.001,P0.001)。相反,轉(zhuǎn)染了antagomir-203的U251親本細(xì)胞對(duì)上述化療藥物的敏感性降低,IC50值顯著增大(P0.001,P0.001,P0.001)；轉(zhuǎn)染了antagomir-203的U87細(xì)胞對(duì)上述三種化療藥物的敏感性亦降低,IC50值顯著增大(P0.001,P0.001,P0.001)。上述結(jié)果表明：上調(diào)miR-203表達(dá)水平可增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性,而下調(diào)miR-203表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生抗藥性。2.3為了進(jìn)一步探討上調(diào)miR-203表達(dá)水平是否可以逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞的EMT特性,我們對(duì)U251AR和U87AR細(xì)胞進(jìn)行了miR-203轉(zhuǎn)染。結(jié)果提示：轉(zhuǎn)染了miR-203的耐藥細(xì)胞形態(tài)學(xué)上發(fā)生了轉(zhuǎn)變,表現(xiàn)為鵝卵石樣上皮細(xì)胞特征,細(xì)胞聚集,粘附生長(zhǎng)。Western blotting檢測(cè)提示EMT上皮標(biāo)志物E-cadherin在轉(zhuǎn)染了miR-203的耐藥細(xì)胞中上調(diào),而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物ZEB1和Vimentin則下調(diào)。另外,transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明：與對(duì)照組相比較,上調(diào)miR-203的表達(dá)水平可顯著降低U251AR和U87AR細(xì)胞的侵襲能力(P0.001,P0.001)；相反,下調(diào)miR-203的表達(dá)水平則可顯著增加細(xì)胞的侵襲能力(P0.001,P0.001)。劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力,結(jié)果提示,U251AR/miR-203和U87AR/miR-203細(xì)胞在24小時(shí)的細(xì)胞愈合率顯著低于相應(yīng)對(duì)照組細(xì)胞,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001；P0.001)；而U251 AR/anti-miR-203和U87AR/anti-miR-203細(xì)胞在24小時(shí)的細(xì)胞愈合率則顯著高于相應(yīng)對(duì)照組細(xì)胞(P0.001；P0.001)。我們還發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比較,上調(diào)miR-203的表達(dá)水平可誘導(dǎo)U251AR和U87AR細(xì)胞凋亡率增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.307, P=0.030;t=-7.100, P=0.002)。2.4采用Mann-Whitney法評(píng)估臨床膠質(zhì)瘤患者miR-203的表達(dá)水平與性別、年齡及WHO腫瘤分級(jí)的相關(guān)性。結(jié)果提示：miR-203的表達(dá)水平與患者的年齡(Z=-0.989,P=0.323)和性別(Z=-1.075,P=0.282)無(wú)關(guān),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而miR-203的表達(dá)水平與患者的腫瘤分級(jí)具有顯著相關(guān)性(WHO Ⅰ-Ⅱ vs. WHO Ⅲ-Ⅳ, Z=-2.866, P=0.004)。3. SNAI2是miR-203的直接靶向基因3.1為了進(jìn)一步研究miR-203調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT和化療耐藥的分子機(jī)制,我們利用miRNAs靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)(miRTarBase、TargetScan和PicTar)分析尋找miR-203的可能靶基因。MiR-203與鋅指轉(zhuǎn)錄因子SNAI2的3'-UTR具有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),提示miR-203對(duì)SNAI2可能具有靶向調(diào)控作用。并且,SNAI2與腫瘤EMT及耐藥性具有一定的相關(guān)性,再結(jié)合前期基因芯片表達(dá)譜分析結(jié)果,我們選擇SNAI2為候選靶向驗(yàn)證基因。3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)提示SNAI2在U251AR和U87AR細(xì)胞的表達(dá)水平較相應(yīng)的親本細(xì)胞顯著上調(diào)(t=-18.696, P0.001;t=-14.567, P0.001)。并且,U251AR細(xì)胞轉(zhuǎn)染了miR-203后,SNAI2的表達(dá)水平顯著下調(diào)(t=6.240,P=0.003),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；相反,U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染了antagomir-203后可顯著上調(diào)SNAI2的表達(dá)水平(t=-3.143,P=0.035)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明了miR-203直接作用于SNAI2,并抑制其表達(dá)。3.3我們還通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了miR-203與SNAI2的直接靶向調(diào)控作用。3.4為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-203與SNAI2基因的靶向調(diào)控關(guān)系,我們檢測(cè)了臨床80例膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本。結(jié)果提示：miR-203在膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)較正常腦組織低,而SNAI2則恰好相反,其在膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)水平較正常腦組織顯著增高。此外,我們還對(duì)80例腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中miR-203和SNAI2 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了相關(guān)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤標(biāo)本中miR-203和SNAI2 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.402,p=0.003)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果從臨床方面進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-203對(duì)SNAI2基因的直接靶向調(diào)控作用。4. SNAI2與膠質(zhì)瘤EMT及化療耐藥性的關(guān)系4.1由于miR-203與SNAI2的靶向關(guān)系,我們推測(cè)SNA12參與了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程及化療耐藥性。我們將短發(fā)夾干擾RNA (shRNA)轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)251AR細(xì)胞,下調(diào)SNAI2的表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染sh-SNAI2的U251AR細(xì)胞,其SNAI2表達(dá)水平較陰性對(duì)照組顯著下調(diào)(F=58.606,P0.001)；免疫熒光實(shí)驗(yàn)從蛋白水平進(jìn)一步證實(shí)sh-SNAI2干擾有效。這表明合成的SNAI2干擾片段可有效下調(diào)SNAI2的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),SNAI2表達(dá)下調(diào)可增加耐藥細(xì)胞U251AR對(duì)化療藥物Imatinib、VP-16和TMZ的敏感性,顯著降低細(xì)胞對(duì)藥物的IC50值(F=256.494, P0.001; F=1011.480, P0.001; F=93.796, P0.001)。此外,U251AR細(xì)胞下調(diào)SNAI2后,形態(tài)上由間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)向鵝卵石樣上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變。與對(duì)照組相比較,U251AR/shSNAI2細(xì)胞的侵襲和遷移能力顯著下降(t=16.056, P0.001; t=8.163,.P=0.001)。Western blotting檢測(cè)提示：下調(diào)SNAI2表達(dá)水平后,可引起EMT上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin上調(diào),以及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物ZEB1和Vimentin的下調(diào)。以上結(jié)果表明,miR-203參與膠質(zhì)瘤EMT的過(guò)程,是通過(guò)對(duì)SNAI2的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。4.2為進(jìn)一步探討在膠質(zhì)瘤親本細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SNAI2是否可誘發(fā)EMT和化療耐藥性,我們構(gòu)建了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)SNAI2的細(xì)胞株U87-pcDNA3.1-SNAI2。檢測(cè)發(fā)現(xiàn),U87-pcDNA3.1-SNAI2細(xì)胞株對(duì)三種化療藥物(Imatinib、VP-16和TMZ)的敏感性均顯著降低(F=47.397, P0.001; F=79.328, P0.001; F=65.099, P0.001),并且細(xì)胞形態(tài)由緊密連接的上皮樣細(xì)胞向松散的間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變。同時(shí),U87-pcDNA3.1-SNAI2細(xì)胞株相對(duì)于陰性對(duì)照組的細(xì)胞侵襲能力顯著增強(qiáng)(t=-6.185,P=0.003),并伴隨著上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的下調(diào),以及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物ZEB1和Vimentin的上調(diào)。此外,過(guò)表達(dá)SNAI2可以逆轉(zhuǎn)miR-203對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT和化療耐藥性的抑制效果。5.MiR-203與臨床膠質(zhì)瘤患者生存期的關(guān)系5.1免疫組化法檢測(cè)35例原發(fā)性和16例復(fù)發(fā)性(經(jīng)替莫唑胺化療6個(gè)月后)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織SNAI2和E-cadherin的蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)：SNAI2在復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)水平高于原發(fā)性；相反,E-cadherin的表達(dá)水平在復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中卻降低。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),SNAI2和E-cadherin mRNA在復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的平均表達(dá)水平分別是原發(fā)性腫瘤組織中的4.05和0.54倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義t=-3.838, P=0.018; t=4.282, P=0.013)。5.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)提示miR-203在復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)水平低于原發(fā)性腫瘤組織(t--4.310,P=0.003)。而且,Log rank法分析結(jié)果表明：miR-203高表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者,其生存期較低表達(dá)的患者長(zhǎng)(P=0.0017),預(yù)后好。結(jié)論1.耐甲磺酸伊馬替尼的膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251AR和U87AR)具有EMT的特性,其侵襲和增殖能力較相應(yīng)的親本細(xì)胞顯著增強(qiáng)。2.MiR-203在膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞株中呈低表達(dá),上調(diào)miR-203可有效逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EMT特性和增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。SNAI2是miR-203的靶基因之一。MiR-203可通過(guò)靶向作用于SNAI2,調(diào)控膠質(zhì)瘤的EMT和參與化療耐藥機(jī)制的調(diào)節(jié)。3. SNAI2在膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞株中呈高表達(dá),下調(diào)SNAI2可增加細(xì)胞對(duì)化療藥物(Imatinib、VP-16和TMZ)的敏感性并抑制EMT過(guò)程。而過(guò)表達(dá)SNAI2則促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變,導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性降低。SNAI2在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平,與化療敏感性相關(guān)。并且,SNAI2參與膠質(zhì)瘤化療耐藥可能是通過(guò)影響細(xì)胞的凋亡實(shí)現(xiàn)的。4.降低或增加SNAI2表達(dá)可以引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力相應(yīng)的降低或者升高。5.MiR-203在復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤組織中低表達(dá),且與臨床患者的生存期及預(yù)后密切相關(guān),miR-203可能作為膠質(zhì)瘤獨(dú)立的預(yù)后因子。綜上所述,本課題的研究結(jié)果表明：SNAI2在miR-203的調(diào)控下,通過(guò)誘導(dǎo)EMT進(jìn)程參與膠質(zhì)瘤耐藥機(jī)制的調(diào)節(jié)。SNAI2可能是膠質(zhì)瘤化療藥物敏感性的可靠標(biāo)志物之一。重新表達(dá)miR-203或下調(diào)SNAI2可有效抑制膠質(zhì)瘤化療耐藥性。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R739.41
【部分圖文】：

通過(guò)ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明；Ｕ２５１ＡＲ??和Ｕ８７ＡＲ發(fā)生ＥＭＴ后，其侵襲能力商于相應(yīng)的親本細(xì)胞Ｕ２５１和Ｕ８７，差異有??統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（戶－１８．４１７，戶＜０．００１；／＝－１１．６６９，戶＜０．００１）（圖１－化；表１－５；表??１－６）。??表１－５?Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ｕ２５１和Ｕ２５１ＡＲ細(xì)胞的侵襲能力??Ｔａｂｌｅ?＾５?Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ?ｉｎｖａｓｉｏｎ?ａｓｓａｙ?ｐｒｏｖｅｓ?孤?ａｌｔｅｒｅｄ?ｉｎｖａｓｉｖｅ?ｂｅｈａｖｉｏｒ?ｏｆ?Ｕ２５１ＡＲ?ｃｅｌｌｓ．?（了；ｔｓ，??ｎ＝５）??ｎ?細(xì)胞侵襲數(shù)目（個(gè)）??Ｕ２５１?５?６１．２００±４．４９４??Ｕ２５１ＡＲ?５?１３８．２００±８．１９８??Ｔｉ?－１８．４１７??戶值?＜０．００１??表１－６?Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ｕ８７和Ｕ８７ＡＲ細(xì)胞的侵襲能力??Ｔａｂｌｅ?＾６?Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ?ｉｎｖａｓｉｏｎ?ａｓｓａｙ?ｐｒｏｖｅｓ?ａｎ?ａｌｔｅｒｅｄ?ｉｎｖａｓｉｖｅ?ｂｅｈａｖｉｏｒ?ｏｆ?Ｕ８７ＡＲ?ｃｅｌｌｓ．（玄±《，??ｎ＝５）??ｎ?細(xì)胞侵襲數(shù)目（個(gè)）??５?３６．０００±６．１２４??Ｕ８７Ａ?民?５?１０３．４００主?１１．３７１??Ｔｉ?－１１．６６９??戶值?＜０．００１??ＣＣＫ－８法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的實(shí)驗(yàn)表明；經(jīng)５０?ｎｇ／ｍｌ的替莫哇胺刺激后，??Ｕ２５１ＡＲ細(xì)胞在４８，?７２，?９６和１２０小時(shí)的増殖能力均高于Ｕ２５１細(xì)胞，差異有??統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｆ＝〇．〇〇４

?相對(duì)于親本細(xì)胞Ｕ８７，１４個(gè)ｍｉＲＮＡｓ在耐藥細(xì)胞Ｕ８７ＡＲ中表達(dá)上調(diào)，而包括??ｍｉＲ－２０３在內(nèi)的１１個(gè)ｍｉＲＮＡｓ表達(dá)則下調(diào)（圖２－１Ａ，Ｂ）。??同時(shí)，我們采用實(shí)時(shí)巧光定量ＰＣ民檢測(cè)膠質(zhì)瘤耐藥和敏感細(xì)胞株中ｍｉＲ－２０３??的表達(dá)水平，レッ進(jìn)一步驗(yàn)證芯片的結(jié)果。采用／檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差齊性檢??查示方差齊，Ｕ２５１ＡＲ中ｍｉ艮－２０３的表達(dá)較敏感細(xì)胞株Ｕ２５１顯著降低，差異具??有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（戶９．４４２，戶＜０．００１，圖２－３Ａ）?；?Ｕ８７ＡＲ中ｍｉＲ－２０３的表達(dá)較敏??感細(xì)胞株Ｕ８７亦顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（戶６．４３９，尸＝０．００１，圖２－３Ａ）。??表明ｍｉＲ－２０３在膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)，與ｍｉＲＮＡ芯片的結(jié)果一致。??Ｂ?ＮＵｃｒｏＲＮＡ?Ｆｏｌｄ?Ｃｈａｎｇｅ??ｈｓｎ－ｉ．．：＊＇：■?０．１４９??ｈｓａ－ｍｉＲ－３１?己?８－５。?０．１８５??－８．３?－１．：?１．８?ｈｓａ．ｍｉＲ＿４５３４?０．２５７??ｆ?ｆ?Ｖ?ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３?０．４２０??？．?ｙ

?第王部分?Ｍ化－２０３通過(guò)把向ＳＮＡ口調(diào)控膠質(zhì)瘤ＥＭＴ和化療耐藥性???ＩＤ?：０?３０?４０?ＳＯ?６０?７０?６０?Ｍ?ｌＯＯ?１??■?．■■瞻垂—?？藝■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■？■■麵■■■■■誦■■禱■■？禱■■■■■麵??Ｃ?Ｔ?、－?｜二．ｆ．?Ｕ?Ｉ－．?．．?ＯＣ?了?．．?．?Ｃ。＜＂－Ｔ?ｔ?Ｃ?＜?Ｃ?Ｔ?．．?．．?Ｃ．?１：?Ｃ?Ｇ?．．?０?■?：?Ｃ．Ｔ?１＇．?ＣＴ?ｒ．?，?，?Ｃ．?ｔ．?〇｜：?：?Ｔ?ｒ?ｒ?．．?０?：?了?１＊?．?－?Ｉ：?Ｃ．?ｒ．巳?ｒ．?．?‘：?ｕ了?ｒ?ｉ：，?了?Ｇ?．?：?〇?廣．〇?：?〇?了。Ｃ?Ｔ?ｉ—．廣，。占?Ｃ?Ｔ?Ｔ，－?Ｃ??

本文編號(hào)：2837083