發(fā)布時間：2020-10-11 20:31

　　 研究背景膠質母細胞瘤(glioblastoma, GBM)在成人中是最常見的腦原發(fā)性惡性腫瘤,其確診后的中位生存期僅為14個月。化學藥物治療(化療)作為腫瘤輔助治療的方式之一,能有效殺滅腫瘤細胞,抑制腫瘤生長及遷移,延長患者生存時間。然而,GBM極易出現(xiàn)化療耐藥現(xiàn)象而導致腫瘤復發(fā),治療失敗。因此,GBM的化療耐藥性已成為近年來膠質瘤臨床治療急需解決的重要問題之一。上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細胞失去細胞極性,丟失細胞間緊密連接和粘附連接,在形態(tài)學上發(fā)生向間質細胞表型的轉變,并獲得更強的遷移、侵襲、增殖以及抗凋亡能力的過程。在EMT過程中,腫瘤細胞脫離原發(fā)灶,侵入細胞外基質和基底膜,向遠處器官發(fā)生轉移,形成新的腫瘤病灶。有研究發(fā)現(xiàn)EMT與腫瘤化療耐藥密切相關。由此,探尋EMT與化療耐藥之間相關性的分子機制,對于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤治療策略意義重大。通過人基因表達譜芯片對膠質瘤耐甲磺酸伊馬替尼細胞株U87AR和非耐藥細胞株U87中21325個基因進行分析,結果發(fā)現(xiàn)U87AR細胞中包含鋅指轉錄因子(SNAI2)在內的1050個基因表達上調,1120個基因表達下調。并且,免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)SNAI2在化療后復發(fā)膠質瘤組織中的表達較原發(fā)膠質瘤組織中的表達增高。鋅指轉錄因子SNAI2 (又稱slug)是Snail超家族成員之一,通過與靶基因啟動子上的E-box結合抑制蛋白轉錄,誘導EMT,使腫瘤細胞變得具有遷移性和侵襲性。最近的研究表明,SNAI2的異常表達參與腫瘤細胞遷移、侵襲、凋亡及血管生成等方面的調控,與腫瘤惡性程度密切相關。然而,SNAI2在膠質瘤耐藥性中的作用目前國內外尚未見相關研究。微小RNA (microRNAs,miRNAs)是真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類非編碼RNA,作為重要的調控因子,其參與多種細胞的生物進程。MiRNAs與靶基因3'非編碼區(qū)(3'-UTR)結合,主要通過轉錄抑制或降解轉錄產物,在轉錄和轉錄后水平調節(jié)靶基因蛋白的表達。MiRNAs在多種正常組織與腫瘤組織中的差異表達譜,表明miRNAs在腫瘤的分類和療效預測中具有重要的意義。越來越多的研究表明miRNA在腫瘤細胞化療耐藥和EMT的過程中扮演著十分重要的角色。比如,在膀胱癌細胞中,miR-27a通過靶向作用于SLC7A11基因,逆轉癌細胞對順鉑的耐藥性。無獨有偶,在人源小細胞肺癌中,miR-135a通過靶向作用于APC基因,調控癌細胞對紫杉醇的藥物敏感性。而且,最近的一項研究表明,在乳腺癌和肺腺癌細胞中miR-200家族參與調控由TGF-p及EMT誘導因子引發(fā)的EMT效應。盡管如此,miRNAs以及它們的靶基因在EMT過程中如何參與化療耐藥的調控,目前具體機制尚未清楚。我們前期采用miRNA芯片對比分析膠質瘤耐藥細胞U87AR和非耐藥細胞U87之間miRNAs的表達譜差異性發(fā)現(xiàn)：miR-203在膠質瘤耐藥細胞株U87AR中的表達較敏感細胞株U87中降低。然而,關于miR-203在膠質瘤化療耐藥中的作用及其分子機制,目前尚未見相關研究報道。另外,cDNA基因芯片對比耐藥細胞株U87AR和親本細胞U87發(fā)現(xiàn)：EMT主要間質標記物(SNAI2、ZEB1和vimentin)在U87AR中的表達明顯高于U87親本細胞。生物信息學分析進一步發(fā)現(xiàn)SNAI2可能是miR-203的潛在靶基因。綜上所述,我們推測EMT可能在SNAI2的調控下參與了膠質瘤耐藥機制的過程。本課題的研究目的為探討SNAI2在miR-203的調控下,可通過誘導EMT,參與膠質瘤耐藥機制的調節(jié)。通過本項目研究,進一步豐富膠質瘤耐藥的分子機制,為膠質瘤耐藥的研究提供依據(jù),為解決臨床棘手的膠質瘤耐藥問題提供一種新的治療策略。材料和方法1.臨床標本收集收集2010年12月至2013年10月間在南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院、珠江醫(yī)院以及三九腦科醫(yī)院接受治療的80例膠質瘤病人的臨床資料及腫瘤組織標本。其中Ⅰ級星形細胞瘤9例,Ⅱ級星形細胞瘤13例,Ⅲ級星形細胞瘤7例和膠質母細胞瘤51例。而在51例膠質母細胞瘤病人中,16例為替莫唑胺化療半年后腫瘤復發(fā)病例。組織標本手術切除后立即冰凍保存,并由病理科行病理學檢查確診。所有確診后的膠質瘤組織標本放-80℃保存,部分行石蠟包埋供后續(xù)實驗使用。本研究經珠江醫(yī)院倫理委員會批準,并在其監(jiān)督下收集病人相關資料,所有患者簽署知情同意書。2.細胞培養(yǎng)人源膠質瘤細胞株U251和U87均從南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院獲取。耐甲磺酸伊馬替尼(Imatinib)細胞株U251AR和U87AR前期已成功構建并保存于南方醫(yī)院中心實驗室。采用含10%胎牛血清和20%青霉素/鏈霉素(雙抗)的DMEM培養(yǎng)基,在37℃、5%二氧化碳以及飽和濕度的條件下傳代培養(yǎng),細胞生長狀態(tài)良好時用于實驗。為了維持細胞的多藥耐藥表型,U251AR和U87AR交替使用無藥培養(yǎng)基和含甲磺酸伊馬替尼(濃度為122 μg/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)。實驗前耐藥細胞株至少在不含伊馬替尼的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周。3.細胞轉染細胞采用陽離子脂質體法進行瞬時轉染。濃度均為100 nmol/L的miR-203模擬物(mimics)、拮抗劑(anti-miR-203)和陰性對照組,以及濃度均為60 nmol/L的SNAI2特異性短發(fā)夾干擾片段和陰性對照組,通過與Lipofectamine 2000及OPTI-MEMI混合后轉染細胞。具體操作按LipofectamineTM 2000試劑說明書進行。而穩(wěn)定轉染則采用LipofectamineTM 2000將表達SNAI2的SNAI2-eGFP-N1-1載體及其空載質粒轉染入膠質瘤細胞,通過濃度為500μg/mL的G418篩選陽性克隆細胞進行擴大培養(yǎng),獲得穩(wěn)定表達SNAI2的細胞株。篩出的穩(wěn)轉細胞株經24小時培養(yǎng)后,可用于后續(xù)基因表達及功能試驗研究。用于轉染實驗的RNA寡核糖核苷酸片段購自上海吉瑪公司,其序列如下所示：RNA oligoribonucleotides SequencemiR-203 mimic 5'-GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG-3' 5'-AGUGGUCCUAAACAUUUCACUU-3'miR-203 mimic NC 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3' 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'miR-203 inhibitor 5'-CUAGUGGUCCUAAACAUUUCAC-3'miR-203 inhibitor NC 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3'4. MiRNA基因芯片分析基因芯片在耐藥細胞株U87AR和親本細胞株U87中進行miRNAs表達譜分析。具體操作如下：按照說明書采用TRIzol (Invitrogen)和RNeasy mini kit (Qiagen)試劑盒抽提細胞總RNA。然后用miRCURYTM Hy3TM/Hy5TM Power labeling kit (Exiqon)試劑標記樣品,并放置于miRCURY LNA Array (Exiqon, version 11.0)進行雜交。而后在Axon GenePix 4000B掃描儀上進行掃描,并使用GenePix pro version 6.0讀取信號強度值。最后我們選取耐藥細胞U87AR和親本細胞U87之間表達差異倍數(shù)在1.5倍以上的miRNAs作為后續(xù)研究對象.5.總RNA的提取、反轉錄及實時熒光定量PCR按照試劑說明書,總RNA通過TRIzol (Invitrogen)提取并分離。取上述RNA進行反轉錄和實時熒光定量PCR。miR-203表達水平的檢測采用miRNAsqPCR Quantitation Kit試劑盒(吉瑪公司),以及加入miRNAs特異性的反轉錄序列和內參U6等嚴格按照試劑盒的說明操作。按實時熒光定量RT-PCR試劑盒說明(TAKARA)檢測SNAI2、ZEB1、E-cadherin和vimentin的mRNA表達水平。實時熒光定量PCR采用SYBR Green作標記,并在ABI7500儀器上運行。選取GAPDH或U6作為內參,三次獨立重復實驗后得到的數(shù)據(jù)運用公式RQ=2-△△ct的方法進行分析。由TAKARA公司設計合成引物序列如下所示：Gene Primer sequencesSNAI2 Forward:5'-TGGTTGCTTCAAGGACACAT-3' Reverse:5'-GTTGCAGTGAGGGCAAGAA-3'ZEB1 Forward:5'-GGGAGGAGCAGTGAAAGAGA-3' Reverse:5'-TTTCTTGCCCTTCCTTTCTG-3'E-cadherin Forward:5'-CCCGGGACAACGTTTATTAC-3' Reverse:5'-GCTGGCTCAAGTCAAAGTCC-3'Vimentin Forward:5'-CCCTCACCTGTGAAGTGGAT-3' Reverse:5'-TCCAGCAGCTTCCTGTAGGT-3'GAPDH Forward:5'-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3' Reverse:5'-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3'miR-203 Order from GenePharma:Lot No.91126N22U6 Order from GenePharma:Lot No.83008710426.免疫印跡(Western blot)檢測蛋白表達提取細胞總蛋白,采用BCA法進行蛋白濃度測定,再經10%SDS-PAGE電泳分離,用半干法電轉移至PVDF膜上。然后,5%脫脂奶封閉1.5h,TBST洗膜后用相應的SNAI2、ZEB1、E-cadherin和vimentin單克隆抗體(Cell Signaling Technology) 4 ℃孵育過夜,洗膜后分別加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗(1：5000),常溫下孵育2h,再洗膜后行ECL化學發(fā)光顯影。GAPDH作內參使用,蛋白相對表達強度采用Quantity One軟件進行定量。7.雙熒光素酶實驗將miR-203位于SNAI2的3'非編碼區(qū)的反應元件(野生型或突變型),克隆至熒光素酶報告基因下游的psiCheck2質粒。然后利用luciferase assay kit試劑盒(Promega)和GloMaxTM 96 Microplate Luminometer發(fā)光檢測儀分別測定Firefly luciferase和Renilla luciferase活性。再以兩者間活性的比值作為熒光素酶的相對活性,進行不同樣品間的比較。8.細胞侵襲實驗取對數(shù)生長期的細胞,用胰酶進行消化并吹勻成單細胞懸液。在鋪好Matrigel膠的Tanswell上室中加入200μl細胞懸液(總的細胞數(shù)量為1×105),下室每室加600μ1含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,37℃溫度及含5%二氧化碳的孵箱培養(yǎng)48小時。隨后取出Tanswell上室,用PBS清洗,棉簽輕輕擦去膜上室面的膠,4%多聚甲醛室溫固定15分鐘,PBS再清洗3次,每次5分鐘,結晶紫染膜15分鐘,PBS清洗干凈,用刀片將膜從小室中剝離出來,將膜下室面朝上置于載玻片上,200倍視野下顯微鏡進行拍照。所有實驗需重復3次以上。9.細胞劃痕及流式細胞術實驗以5×105/cm2的細胞密度接種于六孔板,置入37℃C孵箱培養(yǎng)12小時,使細胞散開生長至完全接觸。更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時,讓細胞處于饑餓狀態(tài)。然后,在鋪開的單層細胞上使用200μ1的槍頭輕輕劃一道痕,并用PBS洗凈。加無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),隨后用NIH Image J軟件測量各個時間點時痕道的寬度。每次實驗至少重復4次以上。流式細胞凋亡檢測,采用Annexin V/Propidium Iodide Detection Kit試劑盒(KeyGEN),嚴格按照試劑說明操作。10.CCK-8法檢測細胞藥物敏感性以每孔1×104個細胞接種于96孔板中,瞬時或穩(wěn)定轉染后培養(yǎng)24小時,然后加入不同濃度(50至200 μg/mL)的甲磺酸伊馬替尼(Imatinib)、依托泊苷(VP-16)和替莫唑胺(TMZ)3種化療藥物。常規(guī)培養(yǎng)48小時后,每孔加入新配制的CCK-8溶液10μl,置入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時后終止培養(yǎng)。震蕩1分鐘后,在酶聯(lián)免疫檢測儀上選取450nm波長,測定各孔光吸收值。取每5個重復孔的光吸收值(A值)的平均值,計算各種轉染細胞在不同濃度的3種化療藥物下的存活率；細胞存活率=(實驗組A值-空白對照組A值)/(陰性對照組A值-空白對照組A值)×100%。每次實驗重復三次,取平均值,分別計算出3種化療藥物的IC50值。細胞增殖活性分析：細胞懸液終體積為100μl,細胞數(shù)2×103每孔,接種于96孔板。用加了替莫唑胺的培養(yǎng)基(50 μg/mL)分別培養(yǎng)細胞24、48、72、96和120個小時。隨后按照試劑說明書采用CCK-8法檢測細胞的生長活性。11.免疫熒光免疫熒光實驗按照標準實驗步驟進行操作。簡而言之,細胞用4%的多聚甲醛進行固定,0.5%的Triton X-100通透細胞膜以及10%的羊血清進行封閉。細胞孵育相應一抗后40C過夜,PBS洗3次,每次5分鐘,繼續(xù)孵育帶有熒光的二抗1小時,再次PBS洗3次,每次5分鐘,用DAPI染核15分鐘后,PBS清洗3次,每次5分鐘。最后將細胞放置于倒置熒光顯微鏡下觀察或拍照。12.免疫組織化學將膠質瘤組織進行石蠟包埋,切片后固定于載玻片上。隨后石蠟切片進行脫蠟、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶及血清封閉。SNAI2和E-cadherin的特異性單克隆抗體孵育濃度為1：200,4℃孵育過夜。每張玻片滴加帶有生物素標記的羊抗兔IgG二抗(1：500),室溫孵育1小時,PBS洗3次,每次5分鐘。每張玻片滴加新配制的DAB溶液,顯微鏡下觀察或拍照。最后,使用中性樹膠封片保存。結果判定：SNAI2和E-cadherin陽性染色時呈棕黃色。13.統(tǒng)計學分析所有結果均經SPSS13.0統(tǒng)計軟件和GraphPad Prism5.0軟件進行分析處理。所有實驗重復3次,定量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示。兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗。實時熒光定量PCR、免疫印跡、細胞侵襲實驗、雙熒光素酶實驗多組間的比較采用完全隨機設計的方差分析。方差齊,進一步的多重比較采用LSD法；方差不齊則采用Dunnettn's T3法。臨床膠質瘤標本組間miR-203表達水平的比較采用Mann-Whitney test統(tǒng)計分析方法。SNAI2和miR-203表達水平的相關性采用Pearson相關分析。MiR-203表達水平與病人生存率的關系采用Log rank法分析。所有實驗P值小于0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。結果1.耐甲磺酸伊馬替尼的膠質瘤細胞與EMT的關系1.1前期已成功構建的耐甲磺酸伊馬替尼的膠質瘤細胞(U251AR和U87AR)對依托泊苷(VP-16)和替莫唑胺(TMZ)具有交叉耐藥的特性。在形態(tài)學方面,U251AR和U87AR細胞失去細胞極性,丟失細胞間緊密連接和黏附連接,呈松散的長梭形間質細胞形態(tài)。通過qRT-PCR和Western blot分別從mRNA和蛋白水平檢測EMT主要上皮標志物(E-cadherin)和間質標志物(ZEB1、Vimentin)在耐藥細胞株及其相應親本細胞中的差異表達。我們發(fā)現(xiàn)：E-cadherin. ZEB1和Vimentin在U251AR中的表達與U251中：(1)mRNA的表達差異具有統(tǒng)計學意義(t=28.238, P0.001)、(t=-4.799, P=0.003)、(t=-9.906, P0.001),表達量分別是U251中的(0.13±0.04)、(3.71±0.41)、(2.15±0.37)倍。(2)蛋白水平的表達差異亦有統(tǒng)計學意義(t=27.678, P0.001)、(t=-14.030, P0.001). (t=-19.856, P0.001),表達量分別是U251中的(0.19±0.02)、(6.11±0.53)、(2.80±0.33)倍。同樣,在U87AR及其親本細胞U87中檢測上述各基因mRNA和蛋白水平的表達。結果提示：E-cadherin、ZEB1和Vimentin在U87AR中的表達與U87中：(1) mRNA的表達差異亦有統(tǒng)計學意義(t=14.003, P0.001)、(t=-52.019, P0.001)、(t=-11.662, P0.001),表達量分別是U87中的(0.30±0.02)、(5.96±0.53)、(2.13±0.29)倍。(2)蛋白水平的表達差異有統(tǒng)計學意義(t=61.417, P0.001)、(t=-114.311, P0.001)、(t=-80.766, P0.001),表達量分別是U87中的(0.31±0.03)、(6.26±0.44)、(2.31±0.28)倍。這與前期的基因表達譜芯片結果一致,從而表明U251AR和U87AR細胞發(fā)生了EMT的轉變。1.2細胞transwell侵襲實驗結果表明,耐藥細胞株U251AR和U87AR的侵襲能力較相應的敏感株U251和U87顯著增強(t=-18.417, P0.001; t=-11.669, P0.001),。通過CCK-8法檢測膠質瘤細胞的增殖能力,我們發(fā)現(xiàn)U251AR細胞在48,72,96和120小時的增殖能力均高于U251細胞,差異有統(tǒng)計學意義(t=-6.132, P=0.004;t=-12.463, P0.001;t=-6.379, P=0.003; t=-5.033, P=0.007);U87AR細胞在48,72,96和120小時的增殖能力均高于U87細胞,差異有統(tǒng)計學意義(t=-2.885, P=0.045;t=-9.175, P=0.001;t=-6.390, P=0.003; t=-20.310, P0.001)。2.MiR-203參與調節(jié)膠質瘤細胞EMT和化療耐藥性2.1我們前期通過miRNA基因芯片高通量篩選了膠質瘤耐藥細胞U87AR和非耐藥細胞U87之間miRNAs的差異表達譜,并應用實時熒光定量PCR驗證篩選得到的差異表達基因。MiRNA芯片分析結果顯示,相對于親本細胞U87,14個miRNAs在耐藥細胞U87AR中表達顯著上調,而包括miR-203在內的11個miRNAs表達顯著下調。實時熒光定量PCR提示miR-203在U87AR細胞中的表達較U87細胞下調5.80倍,差異有統(tǒng)計學意義(t=6.439,P=0.001),進一步驗證了芯片的結果。2.2我們將miR-203模擬物(mimics)和抑制劑(antagomir-203)轉染至膠質瘤細胞,分別上調和下調細胞中miR-203的表達水平,觀察miR-203對細胞藥物敏感性的影響。結果提示：與對照組相比較,轉染了miR-203的U251AR細胞對三種化療藥物(Imatinib、VP-16和TMZ)的敏感性增加,半抑制濃度(IC50值)顯著降低(P0.001,P0.001,P0.001)；轉染了miR-203的U87AR細胞對Imatinib、VP-16和TMZ的敏感性亦增加,IC50值顯著降低(P0.001,P0.001,P0.001)。相反,轉染了antagomir-203的U251親本細胞對上述化療藥物的敏感性降低,IC50值顯著增大(P0.001,P0.001,P0.001)；轉染了antagomir-203的U87細胞對上述三種化療藥物的敏感性亦降低,IC50值顯著增大(P0.001,P0.001,P0.001)。上述結果表明：上調miR-203表達水平可增加膠質瘤細胞對化療藥物的敏感性,而下調miR-203表達則促進細胞產生抗藥性。2.3為了進一步探討上調miR-203表達水平是否可以逆轉耐藥細胞的EMT特性,我們對U251AR和U87AR細胞進行了miR-203轉染。結果提示：轉染了miR-203的耐藥細胞形態(tài)學上發(fā)生了轉變,表現(xiàn)為鵝卵石樣上皮細胞特征,細胞聚集,粘附生長。Western blotting檢測提示EMT上皮標志物E-cadherin在轉染了miR-203的耐藥細胞中上調,而間質細胞標志物ZEB1和Vimentin則下調。另外,transwell侵襲實驗表明：與對照組相比較,上調miR-203的表達水平可顯著降低U251AR和U87AR細胞的侵襲能力(P0.001,P0.001)；相反,下調miR-203的表達水平則可顯著增加細胞的侵襲能力(P0.001,P0.001)。劃痕實驗檢測細胞的遷移能力,結果提示,U251AR/miR-203和U87AR/miR-203細胞在24小時的細胞愈合率顯著低于相應對照組細胞,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.001；P0.001)；而U251 AR/anti-miR-203和U87AR/anti-miR-203細胞在24小時的細胞愈合率則顯著高于相應對照組細胞(P0.001；P0.001)。我們還發(fā)現(xiàn),與對照組相比較,上調miR-203的表達水平可誘導U251AR和U87AR細胞凋亡率增加,差異具有統(tǒng)計學意義(t=-3.307, P=0.030;t=-7.100, P=0.002)。2.4采用Mann-Whitney法評估臨床膠質瘤患者miR-203的表達水平與性別、年齡及WHO腫瘤分級的相關性。結果提示：miR-203的表達水平與患者的年齡(Z=-0.989,P=0.323)和性別(Z=-1.075,P=0.282)無關,差異無統(tǒng)計學意義。而miR-203的表達水平與患者的腫瘤分級具有顯著相關性(WHO Ⅰ-Ⅱ vs. WHO Ⅲ-Ⅳ, Z=-2.866, P=0.004)。3. SNAI2是miR-203的直接靶向基因3.1為了進一步研究miR-203調控膠質瘤細胞EMT和化療耐藥的分子機制,我們利用miRNAs靶基因預測數(shù)據(jù)庫(miRTarBase、TargetScan和PicTar)分析尋找miR-203的可能靶基因。MiR-203與鋅指轉錄因子SNAI2的3'-UTR具有互補結合位點,提示miR-203對SNAI2可能具有靶向調控作用。并且,SNAI2與腫瘤EMT及耐藥性具有一定的相關性,再結合前期基因芯片表達譜分析結果,我們選擇SNAI2為候選靶向驗證基因。3.2實時熒光定量PCR檢測提示SNAI2在U251AR和U87AR細胞的表達水平較相應的親本細胞顯著上調(t=-18.696, P0.001;t=-14.567, P0.001)。并且,U251AR細胞轉染了miR-203后,SNAI2的表達水平顯著下調(t=6.240,P=0.003),差異有統(tǒng)計學意義；相反,U87細胞轉染了antagomir-203后可顯著上調SNAI2的表達水平(t=-3.143,P=0.035)。這些實驗結果充分表明了miR-203直接作用于SNAI2,并抑制其表達。3.3我們還通過雙熒光素酶實驗進一步證實了miR-203與SNAI2的直接靶向調控作用。3.4為了進一步驗證miR-203與SNAI2基因的靶向調控關系,我們檢測了臨床80例膠質瘤組織標本。結果提示：miR-203在膠質瘤組織的表達較正常腦組織低,而SNAI2則恰好相反,其在膠質瘤組織的表達水平較正常腦組織顯著增高。此外,我們還對80例腦膠質瘤組織標本中miR-203和SNAI2 mRNA的表達水平進行了相關性分析,結果發(fā)現(xiàn)在膠質瘤標本中miR-203和SNAI2 mRNA的表達呈負相關性(r=-0.402,p=0.003)。該實驗結果從臨床方面進一步驗證了miR-203對SNAI2基因的直接靶向調控作用。4. SNAI2與膠質瘤EMT及化療耐藥性的關系4.1由于miR-203與SNAI2的靶向關系,我們推測SNA12參與了膠質瘤細胞的EMT過程及化療耐藥性。我們將短發(fā)夾干擾RNA (shRNA)轉染入U251AR細胞,下調SNAI2的表達。實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)：轉染sh-SNAI2的U251AR細胞,其SNAI2表達水平較陰性對照組顯著下調(F=58.606,P0.001)；免疫熒光實驗從蛋白水平進一步證實sh-SNAI2干擾有效。這表明合成的SNAI2干擾片段可有效下調SNAI2的表達。結果發(fā)現(xiàn),SNAI2表達下調可增加耐藥細胞U251AR對化療藥物Imatinib、VP-16和TMZ的敏感性,顯著降低細胞對藥物的IC50值(F=256.494, P0.001; F=1011.480, P0.001; F=93.796, P0.001)。此外,U251AR細胞下調SNAI2后,形態(tài)上由間質細胞形態(tài)向鵝卵石樣上皮細胞形態(tài)轉變。與對照組相比較,U251AR/shSNAI2細胞的侵襲和遷移能力顯著下降(t=16.056, P0.001; t=8.163,.P=0.001)。Western blotting檢測提示：下調SNAI2表達水平后,可引起EMT上皮細胞標志物E-cadherin上調,以及間質細胞標志物ZEB1和Vimentin的下調。以上結果表明,miR-203參與膠質瘤EMT的過程,是通過對SNAI2的調控實現(xiàn)的。4.2為進一步探討在膠質瘤親本細胞中過表達SNAI2是否可誘發(fā)EMT和化療耐藥性,我們構建了穩(wěn)定過表達SNAI2的細胞株U87-pcDNA3.1-SNAI2。檢測發(fā)現(xiàn),U87-pcDNA3.1-SNAI2細胞株對三種化療藥物(Imatinib、VP-16和TMZ)的敏感性均顯著降低(F=47.397, P0.001; F=79.328, P0.001; F=65.099, P0.001),并且細胞形態(tài)由緊密連接的上皮樣細胞向松散的間質樣細胞轉變。同時,U87-pcDNA3.1-SNAI2細胞株相對于陰性對照組的細胞侵襲能力顯著增強(t=-6.185,P=0.003),并伴隨著上皮細胞標志物E-cadherin的下調,以及間質細胞標志物ZEB1和Vimentin的上調。此外,過表達SNAI2可以逆轉miR-203對膠質瘤細胞EMT和化療耐藥性的抑制效果。5.MiR-203與臨床膠質瘤患者生存期的關系5.1免疫組化法檢測35例原發(fā)性和16例復發(fā)性(經替莫唑胺化療6個月后)膠質母細胞瘤組織SNAI2和E-cadherin的蛋白表達水平發(fā)現(xiàn)：SNAI2在復發(fā)性膠質母細胞瘤組織中的表達水平高于原發(fā)性；相反,E-cadherin的表達水平在復發(fā)性膠質母細胞瘤組織中卻降低。通過實時熒光定量PCR檢測,SNAI2和E-cadherin mRNA在復發(fā)性膠質母細胞瘤組織中的平均表達水平分別是原發(fā)性腫瘤組織中的4.05和0.54倍,差異有統(tǒng)計學意義t=-3.838, P=0.018; t=4.282, P=0.013)。5.2實時熒光定量PCR檢測提示miR-203在復發(fā)性膠質母細胞瘤組織中的表達水平低于原發(fā)性腫瘤組織(t--4.310,P=0.003)。而且,Log rank法分析結果表明：miR-203高表達的膠質瘤患者,其生存期較低表達的患者長(P=0.0017),預后好。結論1.耐甲磺酸伊馬替尼的膠質瘤細胞(U251AR和U87AR)具有EMT的特性,其侵襲和增殖能力較相應的親本細胞顯著增強。2.MiR-203在膠質瘤耐藥細胞株中呈低表達,上調miR-203可有效逆轉膠質瘤細胞的EMT特性和增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。SNAI2是miR-203的靶基因之一。MiR-203可通過靶向作用于SNAI2,調控膠質瘤的EMT和參與化療耐藥機制的調節(jié)。3. SNAI2在膠質瘤耐藥細胞株中呈高表達,下調SNAI2可增加細胞對化療藥物(Imatinib、VP-16和TMZ)的敏感性并抑制EMT過程。而過表達SNAI2則促進膠質瘤細胞發(fā)生EMT轉變,導致細胞對化療藥物的敏感性降低。SNAI2在膠質瘤組織中的表達水平,與化療敏感性相關。并且,SNAI2參與膠質瘤化療耐藥可能是通過影響細胞的凋亡實現(xiàn)的。4.降低或增加SNAI2表達可以引起膠質瘤細胞侵襲和遷移能力相應的降低或者升高。5.MiR-203在復發(fā)性膠質瘤組織中低表達,且與臨床患者的生存期及預后密切相關,miR-203可能作為膠質瘤獨立的預后因子。綜上所述,本課題的研究結果表明：SNAI2在miR-203的調控下,通過誘導EMT進程參與膠質瘤耐藥機制的調節(jié)。SNAI2可能是膠質瘤化療藥物敏感性的可靠標志物之一。重新表達miR-203或下調SNAI2可有效抑制膠質瘤化療耐藥性。
【學位單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R739.41
【部分圖文】：

通過ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵襲實驗檢測膠質瘤細胞的侵襲能力。實驗結果表明；Ｕ２５１ＡＲ??和Ｕ８７ＡＲ發(fā)生ＥＭＴ后，其侵襲能力商于相應的親本細胞Ｕ２５１和Ｕ８７，差異有??統(tǒng)計學意義（戶－１８．４１７，戶＜０．００１；／＝－１１．６６９，戶＜０．００１）（圖１－化；表１－５；表??１－６）。??表１－５?Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵襲實驗檢測Ｕ２５１和Ｕ２５１ＡＲ細胞的侵襲能力??Ｔａｂｌｅ?＾５?Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ?ｉｎｖａｓｉｏｎ?ａｓｓａｙ?ｐｒｏｖｅｓ?孤?ａｌｔｅｒｅｄ?ｉｎｖａｓｉｖｅ?ｂｅｈａｖｉｏｒ?ｏｆ?Ｕ２５１ＡＲ?ｃｅｌｌｓ．?（了；ｔｓ，??ｎ＝５）??ｎ?細胞侵襲數(shù)目（個）??Ｕ２５１?５?６１．２００±４．４９４??Ｕ２５１ＡＲ?５?１３８．２００±８．１９８??Ｔｉ?－１８．４１７??戶值?＜０．００１??表１－６?Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵襲實驗檢測Ｕ８７和Ｕ８７ＡＲ細胞的侵襲能力??Ｔａｂｌｅ?＾６?Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ?ｉｎｖａｓｉｏｎ?ａｓｓａｙ?ｐｒｏｖｅｓ?ａｎ?ａｌｔｅｒｅｄ?ｉｎｖａｓｉｖｅ?ｂｅｈａｖｉｏｒ?ｏｆ?Ｕ８７ＡＲ?ｃｅｌｌｓ．（玄±《，??ｎ＝５）??ｎ?細胞侵襲數(shù)目（個）??５?３６．０００±６．１２４??Ｕ８７Ａ?民?５?１０３．４００主?１１．３７１??Ｔｉ?－１１．６６９??戶值?＜０．００１??ＣＣＫ－８法檢測細胞增殖能力的實驗表明；經５０?ｎｇ／ｍｌ的替莫哇胺刺激后，??Ｕ２５１ＡＲ細胞在４８，?７２，?９６和１２０小時的増殖能力均高于Ｕ２５１細胞，差異有??統(tǒng)計學意義（ｆ＝〇．〇〇４

?相對于親本細胞Ｕ８７，１４個ｍｉＲＮＡｓ在耐藥細胞Ｕ８７ＡＲ中表達上調，而包括??ｍｉＲ－２０３在內的１１個ｍｉＲＮＡｓ表達則下調（圖２－１Ａ，Ｂ）。??同時，我們采用實時巧光定量ＰＣ民檢測膠質瘤耐藥和敏感細胞株中ｍｉＲ－２０３??的表達水平，レッ進一步驗證芯片的結果。采用／檢驗進行統(tǒng)計分析，方差齊性檢??查示方差齊，Ｕ２５１ＡＲ中ｍｉ艮－２０３的表達較敏感細胞株Ｕ２５１顯著降低，差異具??有統(tǒng)計學意義（戶９．４４２，戶＜０．００１，圖２－３Ａ）?；?Ｕ８７ＡＲ中ｍｉＲ－２０３的表達較敏??感細胞株Ｕ８７亦顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（戶６．４３９，尸＝０．００１，圖２－３Ａ）。??表明ｍｉＲ－２０３在膠質瘤耐藥細胞中的表達下調，與ｍｉＲＮＡ芯片的結果一致。??Ｂ?ＮＵｃｒｏＲＮＡ?Ｆｏｌｄ?Ｃｈａｎｇｅ??ｈｓｎ－ｉ．．：＊＇：■?０．１４９??ｈｓａ－ｍｉＲ－３１?己?８－５。?０．１８５??－８．３?－１．：?１．８?ｈｓａ．ｍｉＲ＿４５３４?０．２５７??ｆ?ｆ?Ｖ?ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３?０．４２０??？．?ｙ

?第王部分?Ｍ化－２０３通過把向ＳＮＡ口調控膠質瘤ＥＭＴ和化療耐藥性???ＩＤ?：０?３０?４０?ＳＯ?６０?７０?６０?Ｍ?ｌＯＯ?１??■?．■■瞻垂—?？藝■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■？■■麵■■■■■誦■■禱■■？禱■■■■■麵??Ｃ?Ｔ?、－?｜二．ｆ．?Ｕ?Ｉ－．?．．?ＯＣ?了?．．?．?Ｃ。＜＂－Ｔ?ｔ?Ｃ?＜?Ｃ?Ｔ?．．?．．?Ｃ．?１：?Ｃ?Ｇ?．．?０?■?：?Ｃ．Ｔ?１＇．?ＣＴ?ｒ．?，?，?Ｃ．?ｔ．?〇｜：?：?Ｔ?ｒ?ｒ?．．?０?：?了?１＊?．?－?Ｉ：?Ｃ．?ｒ．巳?ｒ．?．?‘：?ｕ了?ｒ?ｉ：，?了?Ｇ?．?：?〇?廣．〇?：?〇?了。Ｃ?Ｔ?ｉ—．廣，。占?Ｃ?Ｔ?Ｔ，－?Ｃ??

本文編號：2837083