研究目的 帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的主要病理特征之一是多巴胺能神經(jīng)元中路易小體的堆積。α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)在腦部以及脊髓表達(dá)較多,是路易小體的主要成分。異常的α-syn會影響遞質(zhì)的釋放,酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)表達(dá)與活性,造成神經(jīng)元氧化應(yīng)激等一系列毒性損傷。自噬是細(xì)胞清除異常細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分的正常生理過程,對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有一定的保護(hù)作用。因此,通過增強(qiáng)自噬清除異常的α-syn是治療帕金森病非常有潛力的方法。單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)在臨床上可用于帕金森病的治療,臨床和動物實(shí)驗(yàn)都證明GM1能夠緩解帕金森病的發(fā)病進(jìn)程,但是GM1的具體作用機(jī)制并不明確,需要更多的研究闡明其機(jī)制。本課題組前期通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GM1能夠改善MPTP模型小鼠行為學(xué)異常和多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的減少,增加紋狀體細(xì)胞自噬體的數(shù)量;細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)GM1可以促進(jìn)α-syn的清除,其作用機(jī)制可能與自噬有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)旨在前期研究的基礎(chǔ)上,深入探究GM1促進(jìn)自噬與α-syn清除之間的關(guān)系,并確定GM1在自噬通路上的靶標(biāo)蛋白。研究方法 首先,本研究在細(xì)胞水平研究GM1促進(jìn)α-syn自噬性降解的作用機(jī)制。在PC12~(α-syn A53T)條件過表達(dá)細(xì)胞中,采用Western blot技術(shù)篩選GM1的最佳作用濃度與作用時間,使用CQ研究溶酶體功能在GM1促進(jìn)α-syn降解中的影響。然后利用Western blot技術(shù)檢測GM1對α-syn以及自噬相關(guān)蛋白ULK1,p-ULK1~(Ser555),p62,LC3表達(dá)的影響;利用3-MA和自噬激活劑rapamycin作比較,確定GM1促進(jìn)自噬與α-syn清除之間的關(guān)系;使用免疫熒光技術(shù)和激光共聚焦成像系統(tǒng)考察GM1,LC3和α-syn共定位情況,進(jìn)一步驗(yàn)證GM1促進(jìn)α-syn自噬性降解。確認(rèn)GM1促進(jìn)α-syn自噬性降解作用基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究GM1在自噬信號通路中靶標(biāo)蛋白。利用ACTP工具預(yù)測和分子對接,預(yù)測GM1潛在靶點(diǎn)。采用q-PCR技術(shù)檢測在SH-SY5Y細(xì)胞給予GM1后,ATG13 mRNA的表達(dá)變化。使用免疫熒光技術(shù)和激光共聚焦成像系統(tǒng)考察GM1對ATG13表達(dá)的影響。通過免疫共沉淀和Western blot技術(shù)檢測GM1對ATG13與ULK1的相互作用的影響,探究GM1是否通過激活A(yù)TG13促進(jìn)ULK1復(fù)合體的形成。最后,使用免疫熒光技術(shù)和激光共聚焦成像系統(tǒng)進(jìn)一步考察GM1與ATG13的共定位情況,進(jìn)一步確定GM1對ATG13的靶向作用。研究結(jié)果:在PC12~(α-syn A53T)條件過表達(dá)細(xì)胞中使用多西環(huán)素(Doxycycline,Dox)誘導(dǎo)12小時,然后給予40μM GM1作用24小時能夠明顯降低α-syn的表達(dá),增加TH的表達(dá),促進(jìn)LC3 I向LC3 II轉(zhuǎn)化,所以選擇40μM作用24小時的給藥方式。CQ能夠抑制GM1對α-syn的降解作用,說明GM1的作用與溶酶體功能相關(guān)。PC12~(α-syn A53T)條件過表達(dá)細(xì)胞經(jīng)DOX誘導(dǎo)后,α-syn表達(dá)顯著上調(diào)(P㩳0.01),給予GM1后能夠顯著改善此情況(P㩳0.01),但是給予3-MA可以顯著逆轉(zhuǎn)GM1的改善作用(P㩳0.01)。與DOX誘導(dǎo)組相比,GM1能夠增加LC3 II和LC3 I的比率(P㩳0.01),減少自噬底物蛋白p62(p㩳0.01)表達(dá),上調(diào)自噬啟動關(guān)鍵蛋白ULK1(P㩳0.01)以及激活相關(guān)的p-ULK1~(Ser555)蛋白(P㩳0.01)的表達(dá),經(jīng)3-MA處理后能逆轉(zhuǎn)上述蛋白表達(dá)情況。利用免疫熒光技術(shù)和激光共聚焦成像系統(tǒng)觀察PC12~(α-syn A53T)條件過表達(dá)細(xì)胞經(jīng)DOX誘導(dǎo)并給予GM1后,LC3與α-syn出現(xiàn)明顯的共定位,表明GM1促進(jìn)自噬體對α-syn的吞噬。GM1通過化學(xué)反應(yīng)接上FITC熒光標(biāo)記,采用激光共聚焦3D成像功能確定帶有FITC熒光標(biāo)記的GM1-FITC能夠在細(xì)胞內(nèi)特異性分布,可用于GM1在細(xì)胞內(nèi)的示蹤。采用免疫熒光技術(shù),使用GM1-FITC進(jìn)一步探究GM1和α-syn或LC3在細(xì)胞內(nèi)的空間關(guān)系,激光共聚焦拍照發(fā)現(xiàn)GM1-FITC與α-syn或LC3皆存在明顯的共定位。以上結(jié)果說明GM1對α-syn的清除作用與其促進(jìn)自噬相關(guān),GM1可能直接參與到自噬體對α-syn的吞噬過程中。計(jì)算機(jī)分子對接結(jié)果顯示,ATG13可能是GM1作用于自噬信號通路的靶標(biāo)蛋白。SH-SY5Y細(xì)胞給予GM1后,ATG13 mRNA的表達(dá)均有一定上升,但無顯著差異(P㧐0.05)。免疫熒光結(jié)果顯示,GM1增加ATG13的表達(dá)量與聚集量,表明GM1促進(jìn)α-syn降解可能與其激活A(yù)TG13蛋白活性相關(guān)。通過免疫共沉淀和Western blot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)GM1上調(diào)ATG13蛋白的表達(dá),并增加ATG13與ULK1的相互作用,說明GM1對ATG13的激活最終會促進(jìn)ULK1復(fù)合體的形成。激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)GM1與ATG13有明顯共定位,說明GM1與ATG13空間上存在相互作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GM1能夠通過上調(diào)ATG13表達(dá),增加其與ULK1蛋白的結(jié)合,最終激活下游自噬通路。結(jié)論:Western blot和免疫熒光等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,GM1能夠增加異常α-syn的清除作用,促進(jìn)其自噬性降解;免疫熒光和免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GM1靶向作用ATG13,增強(qiáng)其與ULK1的結(jié)合。
【學(xué)位單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R742.5
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略詞表
第一章 前言
    第一節(jié) 帕金森病的背景
    第二節(jié) Α-SYN與帕金森病
        2.1 α-syn的結(jié)構(gòu)與生理功能
        2.2 異常α-syn與帕金森病
    第三節(jié) Α-SYN與自噬
        3.1 自噬與帕金森病
        3.2 α-syn與自噬的聯(lián)系
        3.3 自噬調(diào)節(jié)在帕金森病治療中的前景
    第四節(jié) GM1神經(jīng)節(jié)苷脂
        4.1 GM1的結(jié)構(gòu)及生理功能
        4.2 GM1在神經(jīng)退行性疾病中的作用研究
    第五節(jié) 立題依據(jù)和研究內(nèi)容
第二章 GM1促進(jìn)Α-SYN降解的作用機(jī)制研究
    第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 細(xì)胞株
        1.2 主要藥品與試劑
        1.3 主要儀器
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法
α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及凍存'>        2.1 PC12^α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及凍存
        2.2 細(xì)胞給藥方式
α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞的作用濃度與時間'>        2.3 Westernblot篩選GM1在PC12^α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞的作用濃度與時間
        2.4 Westernblot測定溶酶體在GM1促進(jìn)α-syn降解中的作用
        2.5 Westernblot測定GM1對α-syn蛋白表達(dá)水平的影響
        2.6 westernblot測定GM1對自噬信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響
α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)α-syn與LC3共定位的影響'>        2.7 激光共聚焦成像檢測GM1對PC12^α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)α-syn與LC3共定位的影響
        2.8 GM1-FITC的合成步驟
α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的分布情況'>        2.9 激光共聚焦3D成像觀察GM1-FITC在PC12^α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的分布情況
α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞GM1-FITC與α-syn共定位情況'>        2.10 激光共聚焦成像檢測PC12^α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞GM1-FITC與α-syn共定位情況
α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞GM1-FITC與LC3共定位情況'>        2.11 激光共聚焦成像檢測PC12^α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞GM1-FITC與LC3共定位情況
        2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 GM1作用濃度篩選
        3.2 GM1作用時間篩選
        3.3 溶酶體功能在GM1促進(jìn)α-syn降解中影響
α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞中α-syn和TH表達(dá)的影響'>        3.4 GM1對PC12^α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞中α-syn和TH表達(dá)的影響
α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響'>        3.5 GM1對PC12^α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)α-syn與LC3共定位的影響'>        3.6 GM1對PC12^α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)α-syn與LC3共定位的影響
α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的三維分布'>        3.7 GM1-FITC在PC12^α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的三維分布
α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)GM1-FITC與α-syn的共定位'>        3.8 PC12^α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)GM1-FITC與α-syn的共定位
α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)GM1-FITC與LC3的共定位'>        3.9 PC12^α-synA53T條件過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)GM1-FITC與LC3的共定位
    第四節(jié) 小結(jié)與討論
第三章 GM1在自噬信號通路中靶標(biāo)蛋白的研究
    第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 細(xì)胞株
        1.2 主要藥品與試劑配置
        1.3 主要儀器
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 SH-SY5Y細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及凍存
        2.2 GM1靶標(biāo)蛋白的預(yù)測及分子對接
        2.3 Q-PCR測定GM1對ATG13mRNA表達(dá)水平的影響
        2.4 激光共聚焦成像檢測GM1對SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ATG13的影響
        2.5 免疫共沉淀測定GM1對SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ATG13與ULK1相互作用的影響
        2.6 激光共聚焦成像檢測SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)GM1-FITC與ATG13共定位情況
        2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 GM1作用自噬信號通路的靶標(biāo)蛋白預(yù)測
        3.2 GM1對SH-SY5Y細(xì)胞中ATG13mRNA表達(dá)的影響
        3.3 GM1對SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ATG13的影響
        3.4 GM1增加SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ATG13與ULK1相互作用
+誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型中GM1-FITC與ATG13的共定位'>        3.5 MPP⁺誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型中GM1-FITC與ATG13的共定位
    第四節(jié) 小結(jié)與討論
第四章 總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
碩士期間論文成果
致謝

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 李曉曉;自噬介導(dǎo)的α-突觸核蛋白降解在GM1緩解MPTP所致的帕金森病中的作用研究[D];暨南大學(xué);2015年

本文編號：2829695