目的由于人口老齡化的原因,神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率和致殘率越來(lái)越高,在社會(huì)經(jīng)濟(jì)方面產(chǎn)生了相當(dāng)大的影響,越來(lái)越多的證據(jù)表明,帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)和肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制不僅涉及到神經(jīng)元,而且還與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的免疫反應(yīng)有很大的關(guān)系,特別是小膠質(zhì)細(xì)胞.本文旨在探討受體拮抗劑5-BDBD對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎性小體活化的影響。方法取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn),采用脂多糖(LPS)+三磷酸腺苷(ATP)雙信號(hào)干預(yù),建立NLRP3炎性小體活化的模型。按照不同干預(yù)方法將BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分為8組:正常對(duì)照組、ATP組、LPS組、LPS+ATP組、5-BDBD組、ATP+5-BDBD組、LPS+5-BDBD組和LPS+ATP+5-BDBD組。應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)LPS和ATP對(duì)BV2細(xì)胞活力的影響,以為后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取適宜的藥物濃度;Real time PCR檢測(cè)各組NLRP3、P2X4 mRNA表達(dá)水平;Western blot技術(shù)測(cè)定P2X4、NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)的蛋白表達(dá)水平;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法測(cè)定細(xì)胞上清液中IL-1β釋放水平。結(jié)果如下:1.CCK-8的結(jié)果顯示1μg/m L的LPS以及0-1mmol/L的ATP濃度均不影響B(tài)V2細(xì)胞的活力(P0.05),而2mmol/L以上的ATP濃度則對(duì)BV2細(xì)胞的存活率產(chǎn)生影響,我們選取的2mmol/L、3mmol/L、5mmol/L的ATP濃度組BV2細(xì)胞的活力均較對(duì)照組偏低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.001,P0.001)。雖然2mmol/L的ATP濃度對(duì)細(xì)胞出現(xiàn)了損傷作用,影響了細(xì)胞的活力(79.52±3.873%),但是通過(guò)我們后續(xù)的預(yù)試驗(yàn)以及閱讀大量文獻(xiàn),證明2mmol/L以下的ATP濃度和LPS共同作用不能很好的激活下游通路,而2mmol/L的ATP和1μg/mL的LPS具有較好的相容性,也能很好的激活其下游通路,因此,我們選取了1μg/mL的LPS、2mmol/L的ATP作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的藥物濃度。2.Real time PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比較,LPS組和LPS+ATP組的NLRP3mRNA水平均明顯增高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001,P0.001),并且與LPS組相比,LPS+ATP組的NLRP3 mRNA水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);和對(duì)照組相比較,加入2mmol/L的ATP處理BV2細(xì)胞3 h后,其P2X4 mRNA表達(dá)明顯增加,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。3.Western blot檢測(cè)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,在加入2mmol/L的ATP處理3 h后,BV2細(xì)胞中的P2X4蛋白表達(dá)明顯增加,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);和對(duì)照組相比,LPS+ATP雙信號(hào)處理BV2細(xì)胞后NLRP3蛋白水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),而單獨(dú)用LPS或ATP處理的BV2細(xì)胞中NLRP3蛋白水平與對(duì)照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);和對(duì)照組比較,LPS組和ATP組中caspase-1(P10)蛋白水平的變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),LPS+ATP組的caspase-1(P10)蛋白表達(dá)水平明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),但是在加入P2X4受體拮抗劑5-BDBD后結(jié)果提示,LPS+ATP+5-BDBD組的caspase-1(P10)蛋白表達(dá)水平較LPS+ATP組明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。4.用ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中IL-1β的含量,結(jié)果提示,與對(duì)照組相比,LPS組和ATP組上清液中IL-1β含量的變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),LPS+ATP雙信號(hào)處理BV2細(xì)胞后,上清液中IL-1β的含量顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),但是在加入P2X4受體拮抗劑5-BDBD后結(jié)果提示,與LPS+ATP組相比較,LPS+ATP+5-BDBD組上清液中IL-1β的含量明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論P(yáng)2X4受體拮抗劑5-BDBD能夠抑制LPS+ATP雙信號(hào)激活BV2細(xì)胞中NLRP3炎性小體后的炎性效應(yīng),包括caspase-1(P10)的活化及IL-1β的的產(chǎn)生,這將為神經(jīng)退行性疾病的抗炎治療提供新的思路。
【學(xué)位單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R741
【部分圖文】：

高濃度的 ATP（mmol/L 以上）可以通過(guò)與其特異性配體（嘌呤外的離子平衡，引起細(xì)胞損傷甚至凋亡。此時(shí)，細(xì)胞的存活。為了進(jìn)一步確定 BV2 細(xì)胞和我們實(shí)驗(yàn)所用藥物的相容性，適的藥物濃度，我們用不同濃度的 ATP 作用于 BV2 細(xì)胞（ LPS 的濃度為 1μg/mL），采用 CCK-8 法測(cè)定各組的細(xì)胞活細(xì)胞活力及細(xì)胞存活率是 100%。CCK-8 的結(jié)果顯示 1μg/mLol/L 的 ATP 濃度不影響 BV2 細(xì)胞的活力，而 2mmol/L 以上2 細(xì)胞的存活率產(chǎn)生影響，我們選取的 2mmol/L、3mmol/L、組 BV2 細(xì)胞的活力均較對(duì)照組低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.001）。雖然 2mmol/L 的 ATP 濃度對(duì)細(xì)胞出現(xiàn)了損傷作用力(79.52±3.873%), 但是通過(guò)我們后續(xù)的預(yù)試驗(yàn)以及閱讀大/L 以下的 ATP 濃度和 LPS 共同作用不能很好的激活下游通 ATP 和 1μg/mL 的 LPS 具有較好的相容性，也能很好的激活通路，因此，我們選取 1μg/mL 的 LPS、2mmol/L 的 ATP 作濃度（圖 1）。

結(jié)果S 和 ATP 對(duì)各組 NLRP3 mRNA 水平的影響對(duì)照組相比較，LPS 組以及 LPS+ATP 組的 NLRP3 mRNA 水平異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，P<0.001)；與 LPS 組相比較，LRP3 mRNA 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明 TP 干預(yù)都能使 BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞 NLRP3 mRNA 表達(dá)水平上調(diào)(

圖 3 Western blot 檢測(cè)各組 NLRP3 蛋白水平變化( x ±S.E.M，n=3)ig 3 Expression of NLRP3 protein in each group using Western blot ( ±S.E.M，與對(duì)照組比較，***P<0.001。s： ATP=adenosine triphosphate ； LPS=lipopolysaccharide ； NLRP3=NOD-like receptor proteipared with control group，***P<0.001.LPS 和 ATP 對(duì)各組 caspase-1（P10）蛋白水平的影響Western blot 檢測(cè)結(jié)果表明，和對(duì)照組比較，LPS+ATP 組的 caspase-1（P表達(dá)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，而 LPS 組和 ATP pase-1（P10）蛋白水平與對(duì)照組相比均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0.05），+ATP 共同作用可以使 BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞 pro-caspase-1 活化為 caspase-（1 4)。

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本文編號(hào)：2825306