目的:構(gòu)建大腦中動脈閉塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型,模擬人類缺血性腦卒中疾病,觀察高表達腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)及其源性外泌體(Exosome,Exo)移植治療對MCAO大鼠模型的療效,探討高表達BDNF-MSCs源性外泌體對MCAO大鼠腦損傷的保護作用及可能機制。方法:選取重量約為250-300g左右的健康雄性成年SD大鼠,用Longe線栓法構(gòu)造MCAO模型。采用五級四分法,將成功建模的MCAO大鼠隨機分組如下(n=8只):模型對照組(MCAO組)、高表達BDNF-MSCs移植組(MCAO+MSCs組)、高表達BDNF-MSCs源性Exo移植組(MCAO+Exo組),另設(shè)一組空白對照組(Control組)。于缺血2h再灌注24h后通過尾靜脈注射移植行各組移植治療干預(yù)。分別于第1、3、7、14天觀察各組神經(jīng)行為學(xué)評分,14天后處死各組大鼠并取標(biāo)本,通過HE染色腦組織,計算各組腦梗死相對面積,并觀察腦組織梗死顯微結(jié)構(gòu),評估神經(jīng)壞死程度。通過免疫熒光染色統(tǒng)計各組腦組織Ki-67蛋白陽性細胞表達率,觀察腦組織腦細胞增殖情況,評估各組腦修復(fù)改善水平;Western blot檢測BDNF、pTrkB、PI3K和pAkt表達情況。運用Graphpad prism8.0軟件分析數(shù)據(jù)并作圖。結(jié)果:1、外泌體的鑒定與檢測:(1)電鏡顯示經(jīng)典外泌體膜狀結(jié)構(gòu)及中央低電子密度成分;(2)WB檢測外泌體特異性Markers:CD63及TSG101富集性表達;(3)BDNF-Elisa檢測:與自然表達BDNF-MSCs組相比,高表達組外泌體內(nèi)BDNF含量顯著升高(P0.01),低表達組外泌體BDNF含量下降(P0.05)。2、大鼠神經(jīng)行為學(xué)功能學(xué)評分:(1)第1d,各移植治療組與MCAO組所得評分相比,無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);(2)與MCAO組相比較,各移植治療組在第3d、7d、14d的longa評分呈下降趨勢(P0.05);(3)高表達BDNF-MSCs移植組與其源性外泌體移植組所得longa評分下降趨勢差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。3、治療后各組大鼠梗死程度:(1)各移植治療組梗死相對面積較MCAO組均下降(P0.01),且高表達BDNF-MSCs組與其源性外泌體移植組梗死相對面積差異無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。4、腦組織顯微鏡形態(tài)學(xué)表現(xiàn):(1)MCAO組紋狀體可見大量紊亂排列的壞死神經(jīng)細胞、間質(zhì)水腫、神經(jīng)元胞漿濃縮深染、細胞核碎裂或溶解或不成形;(2)高表達BDNF-MSCs移植組及其源性外泌體移植組均可見壞死神經(jīng)元在一定程度上有所減少及間質(zhì)稀疏水腫的改善,神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較為完整,間質(zhì)水腫程度較輕。5、免疫熒光染色Ki-67蛋白表達:(1)MCAO組Ki-67蛋白陽性細胞率上升(P0.05),各移植組陽性率較MCAO組呈進一步上升趨勢(P0.01),且移植組間陽性率上升程度無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。6、BDNF、pTrkB、PI3K和pAkt蛋白Western blot結(jié)果:(1)MCAO組大鼠腦組織內(nèi)BDNF相對表達水平顯著下降(P0.01),各移植治療組腦組織BDNF表達水平均顯著上升(P0.01),且高表達BDNF-MSCs組與其源性外泌體移植組BDNF表達水平上升程度差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);(2)MCAO組大鼠腦組織內(nèi)pTrkB相對表達水平顯著下降(P0.01),各移植治療組腦組織TrkB表達水平均上升(P0.05),且高表達BDNF-MSCs組與其源性外泌體移植組pTrkB表達水平上升程度差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);(3)MCAO組大鼠腦組織內(nèi)PI3K相對表達水平下降(P0.01),各移植治療組腦組PI3K表達水平均上升(P0.05),且高表達BDNF-MSCs組與其源性外泌體移植組PI3K表達水平上升程度差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);(4)MCAO組大鼠腦組織內(nèi)pAkt相對表達水平顯著下降(P0.05),各移植治療組腦組織pAkt表達水平均上升(P0.05),且高表達BDNF-MSCs組與其源性外泌體移植組pAkt表達水平上升程度差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);結(jié)論:1、隨著MSCs內(nèi)BDNF表達增加,其分泌的外泌體內(nèi)含BDNF增加;2、高表達BDNF-MSCs源性外泌體對MCAO大鼠腦損傷具有保護作用,其可能機制是通過PI3K/Akt信號通路的激活發(fā)揮腦保護作用。
【學(xué)位單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R743.3
【部分圖文】：

3.1 MSCs 源性外泌體鑒定3.1.1 形態(tài)學(xué)電鏡及 Western blot 方法鑒定高表達、自然表達、低表達 BDNF-MSCs 擴培養(yǎng)，待細胞融合度為 60-70%后，換成新鮮的無外泌體血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 24-48h，細胞融合度達 80-95%時，收集培養(yǎng)基上清液，超速離心過濾，按試劑盒步驟提取外泌體。通過透射電子顯微鏡可看到數(shù)個異質(zhì)性圓形或類似圓形微小囊泡小體，直徑約 30-100nm(圖 A)，電鏡圖片清晰顯示外周膜性結(jié)構(gòu)及中央低電子密度成分。分別提取的高表達、自然及低表達 BDNF-MSCs 源性微囊泡，Western blot 定性結(jié)果顯示所提取微囊泡陽性表達外泌體特異性 Markers:TSG101 及 CD63（圖 B）。結(jié)合透射電鏡的經(jīng)典外泌體結(jié)構(gòu)以及 Western blot 定性實驗結(jié)果可鑒定提取物確實為外泌體，而非其他細胞碎片及微小囊泡等結(jié)構(gòu)。

結(jié)果如下所示（表 1，圖 2，3）：（1）與自然表達 BDN BDNF 含量相比，高表達 BDNF-MSCs 源性外泌體組內(nèi)1），低表達 BDNF-MSCs 源性外泌體組內(nèi)含量下降（P＜0表 1 自然表達、高表達及低表達 BDNF-MSCs-Exo 濃度（ X±SN 濃度（pg/ml）BDNF-MSCs源性外泌體組 3 22.47±2.97DNF-MSCs 源性外泌體組 3 46.75±7.95**DNF-MSCs 源性外泌體組 3 12.65±3.91*表達 BDNF-MSCs 源性外泌體組相比，P＜0.05，** P＜0.01。

圖 3 BDNF 標(biāo)準(zhǔn)品 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線2 大鼠缺血再灌注模型的成功制備在所需大鼠進行缺血再灌注術(shù)后 2h，對術(shù)后清醒大鼠進行評估大鼠表現(xiàn)為對側(cè)肢體癱瘓，運動時向一側(cè)偏斜，類似圓周運動。鼠對側(cè)偏癱側(cè)肢體內(nèi)收、屈曲時肌張力增高。輕度缺血再灌注表現(xiàn)為完全伸展，前肢較為明顯，中度表現(xiàn)為大鼠向一側(cè)行圓周運動，重側(cè)傾倒。模型制備圖片如下（圖 4、5）：圖 4 可見血管的成功結(jié)扎插入目標(biāo)部位，并標(biāo)記外露線栓尾端。圖 5 可見大鼠右側(cè)肢體得偏側(cè)肢體前爪最為明顯，并向一側(cè)行圓周運動。

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1 宋歌;呂月濤;狄林林;宗文納;陳伯旺;;早期腸內(nèi)營養(yǎng)對重癥肺炎大鼠免疫功能的影響分析[J];中國醫(yī)學(xué)前沿雜志(電子版);2017年01期

2 葉敏;陳達柔;陳宇中;杜少冰;杜展鑫;李玉鳳;唐s鉈

本文編號：2815164