研究背景疼痛,作為第五大生命體征,越來越引起臨床關(guān)注。而有效緩解或根除患者的疼痛自然成為一個關(guān)鍵。腰腿痛是目前最廣泛的病癥之一,多與椎間盤突出相關(guān),有許多研究學者已經(jīng)發(fā)現(xiàn),神經(jīng)根炎(Radiculitis)是導(dǎo)致頑固的根性疼痛禍首之一。研究和探討神經(jīng)根炎的致病機理和臭氧治療的內(nèi)在機制能為臨床診治提供新的理論依據(jù)以及潛在的作用靶點。神經(jīng)根炎(Radiculitis)在臨床上主要表現(xiàn)為神經(jīng)束膜炎癥或炎性浸潤后的背根神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)根炎癥。神經(jīng)根炎患者常出現(xiàn)電生理異常,神經(jīng)傳導(dǎo)減慢,廣泛的軸突損傷等情況。引起神經(jīng)根炎的原因及機制概括起來主要有以下幾個方面。(1)機械性壓迫(compression)產(chǎn)生神經(jīng)根炎。大量研究表明,神經(jīng)根無結(jié)締組織保護鞘,對機械壓迫較為敏感,壓迫對神經(jīng)根產(chǎn)生直接機械效應(yīng),并通過損害神經(jīng)血供與營養(yǎng)而產(chǎn)生神經(jīng)根炎。臨床上腰椎間盤突出癥,突出髓核壓迫神經(jīng)根,可造成神經(jīng)根炎,引起患者肢體疼痛。(2)化學介質(zhì)性神經(jīng)根炎假說。腰椎間盤突出癥中,突出的髓核和纖維環(huán)刺激,會引起肥大細胞出現(xiàn)在受損區(qū)域神經(jīng)外膜和內(nèi)膜以及神經(jīng)囊膜,釋放一些炎癥介質(zhì)如組胺,它們刺激神經(jīng)根和竇椎神經(jīng),導(dǎo)致神經(jīng)根中滲出大量炎性蛋白,增加了神經(jīng)內(nèi)壓力,引起局部缺血和電解質(zhì)紊亂,導(dǎo)致神經(jīng)根炎,從而引起神經(jīng)支配區(qū)的疼痛。其他物質(zhì)如神經(jīng)肽類在疼痛感受中也起重要作用,這些致痛物質(zhì)直接激發(fā)疼痛和降低疼痛閾值。(3)自身免疫假說。有學者認為隨著椎間盤老化或退變,髓核中基質(zhì)降解酶增加,使糖蛋白及連接蛋白裂解為高度異質(zhì)性分子,在退變纖維環(huán)出現(xiàn)裂隙后漏出來,產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)。退變椎間盤組織中免疫球蛋白的沉積、淋巴細胞和巨噬細胞的浸潤可介導(dǎo)自體免疫反應(yīng)引起椎間盤和神經(jīng)根的損傷,但有關(guān)神經(jīng)根痛的免疫反應(yīng)機理尚需進一步研究。機械壓迫學說中的壓迫、化學性神經(jīng)根炎學說中的炎癥刺激及自身免疫學說中的免疫反應(yīng)三者之間是互相促進互為調(diào)節(jié)的。機械性壓迫,可使局部血管通透性增加,血管-神經(jīng)屏障破壞,神經(jīng)內(nèi)水腫,神經(jīng)內(nèi)液壓升高,進一步阻斷血供,異常神經(jīng)遞質(zhì)釋放以及炎癥反應(yīng),使神經(jīng)根受刺激產(chǎn)生癥狀。同時神經(jīng)根內(nèi)炎癥細胞和纖維細胞浸潤,形成纖維疤痕,又會加重神經(jīng)根的壓迫。持續(xù)的化學刺激和炎癥反應(yīng)可以導(dǎo)致免疫反應(yīng)的發(fā)生;在免疫反應(yīng)的作用下,許多神經(jīng)多肽可以釋放出來,而又加重刺激和炎癥。但有關(guān)神經(jīng)根炎的致病機制還不夠完善,有待進一步研究。自噬(autophagy)稱為 Ⅱ 型程序性細胞死亡(type Ⅱ programmed cell death),是真核細胞特有的生命現(xiàn)象,維持蛋白代謝平衡及細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。在真核物種調(diào)控細胞內(nèi)物質(zhì)代謝周轉(zhuǎn)中起非常重要的作用。細胞自噬分為微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(Chaperone-mediated autophagy,CMA)三種類型。自噬發(fā)生時,染色質(zhì)并不發(fā)生凝聚,Caspase(天冬氨酸半胱氨酸特異性蛋白酶)也并不參與該過程,然而,細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體。自噬體包裹細胞質(zhì)和受損細胞器,再與溶酶體融合,形成單層膜的自噬溶酶體,并借助溶酶體內(nèi)水解酶的作用,分解內(nèi)容物,所降解的物質(zhì)可以被細胞再利用。自噬過程受到一組進化上保守的自噬相關(guān)基因(autophagy associated gene,ATG)的嚴格調(diào)控。細胞內(nèi)自噬過度或自噬不足都可能引發(fā)人類疾病,例如腫瘤、衰老和神經(jīng)退行性疾病等。凋亡即Ⅰ型程序性細胞死亡(type Ⅰ programmed cell death),是指由體內(nèi)外因素觸發(fā)細胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細胞死亡過程,為程序性細胞死亡(programmed cell death,PCD)的形式之一,與生命體的生長發(fā)育,清除損傷和衰老的細胞,以及防止癌細胞的發(fā)生有著密切的關(guān)系,是細胞的一種基本生物學現(xiàn)象。機體在生理情況下通過凋亡清除衰老或多余的細胞,凋亡也會在病理情況下被誘發(fā)。凋亡過程包括Caspase家族蛋白酶水解酶的參與、染色質(zhì)凝聚、細胞皺縮、DNA降解和片段化、凋亡小體形成等。在這一過程中細胞內(nèi)容物-般不發(fā)生外泄,故不會引起炎癥反應(yīng)。當細胞受到如糖皮質(zhì)激素、熱、輻射、營養(yǎng)缺乏、病毒感染、缺氧和細胞內(nèi)鈣濃度增加等刺激時,細胞內(nèi)凋亡信號即可被釋放。細胞凋亡主要通過線粒體途徑或內(nèi)在途徑、死亡受體介導(dǎo)的途徑或外在途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑以及非caspase依賴性途徑被觸發(fā)。大量研究表明,自噬與凋亡通路之間存在著錯綜復(fù)雜的對話(Cross-talk),兩者有共同的刺激因子和調(diào)節(jié)蛋白。目前認為,凋亡和自噬在介導(dǎo)細胞死亡過程中,存在著如下幾種可能的關(guān)系:凋亡和自噬協(xié)同促進細胞死亡,二者可能同時或先后被活化,協(xié)同調(diào)控細胞死亡;凋亡和自噬互為拮抗,自噬通過加速受損細胞器或蛋白聚集物的清除,使大分子物質(zhì)得以循環(huán)利用,保護細胞免于凋亡;自噬促進凋亡相關(guān)特征的顯現(xiàn),但自噬并不作為誘發(fā)細胞死亡的直接原因。眾多調(diào)控元件參與凋亡和自噬的交互應(yīng)答機制,包括Beclin1、Bcl-2家族蛋白p53等。在神經(jīng)根炎發(fā)生發(fā)展過程中是否存在神經(jīng)細胞凋亡和自噬尚不清楚。臭氧是一種無色、有刺激性氣味的氣體,具有不穩(wěn)定、難以儲存、強氧化性、常溫常壓狀態(tài)下大約四五十分鐘就會轉(zhuǎn)化成氧氣等特點。臭氧的使用是一把“雙刃劍”,當高濃度或大劑量使用的時候,臭氧對于生物體有著嚴重的副作用,然而小劑量的較低濃度的臭氧卻可以有效的提高血液抗氧化能力。眾所周知,醫(yī)用臭氧具有“殺菌、抗病毒、消炎、鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)”等多種生物功能,在臨床上已經(jīng)用于腰間盤突出、疼痛、創(chuàng)傷及難治性潰瘍、中風和病毒性肝炎等疾病的治療,而且均有良好的效果。截至目前,關(guān)于臭氧療法的作用機制包括較低濃度的臭氧可以使髓核脫水、縮小,從而一定程度上緩解椎間盤的壓迫;醫(yī)用臭氧可以刺激抗炎因子IL-10和成纖維生長因子-β1(TGF-β1)的釋放,可以抑制凋亡蛋白和IL-1β的過度表達,能較好地改善局部氧供,從而減輕炎性反應(yīng)。但基于自噬和凋亡理論來探討關(guān)于低濃度臭氧治療神經(jīng)根炎的內(nèi)在機制,鮮有研究。鑒于此,本論文擬通過建立大鼠神經(jīng)根炎模型,觀察神經(jīng)根炎大鼠脊髓組織自噬及凋亡的表達特征,觀察低濃度醫(yī)用臭氧對根神經(jīng)炎的治療作用,并且從自噬結(jié)合凋亡的角度初步探討臭氧治療根神經(jīng)炎的可能機制。第一部分神經(jīng)根炎大鼠脊髓組織的自噬和凋亡方法:選取健康清潔級250-300g的Wistar大鼠36只,雌雄不限,隨機分為二組,每組18只:模型組(Model group)和假手術(shù)組(Shamgroup)。模型組為弗氏佐劑致神經(jīng)根炎組,將包含50ul完全性弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant)CFA的止血氧化纖維素放在L5背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)上,致根性神經(jīng)炎。假手術(shù)組椎板切除后,暴露L4/5右側(cè)椎間孔及L5背根神經(jīng)節(jié),放置包含50ul生理鹽水的止血氧化纖維素。在造模成功后8h、24h、72 h各組分別取3只大鼠,取脊髓,保留L5背根神經(jīng)節(jié),行電鏡觀察、免疫熒光雙標檢測LC3Ⅱ/NeuN表達、免疫組化檢測Caspase3表達、RT-PCR法測定組織中Beclinl、LC3B、PDE2A、NF-κBp65mRNA 水平、Western blotting 測定組織中 Beclin1、LC3B、PDE2A、NF-KBp65的蛋白水平,統(tǒng)計分析各組差異的顯著性。結(jié)果:1.透射電鏡觀察:通過采用電子顯微鏡觀察胞質(zhì)中的自噬體來研究神經(jīng)根炎癥大鼠模型中脊髓組織的自噬情況。結(jié)果表明,手術(shù)造模后,在8 h、1天和3天脊髓組織細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)一些自噬體,其包含異常結(jié)構(gòu)高電子密度物質(zhì)(如雙膜)和許多細胞器。2.免疫熒光雙標檢測LC31Ⅱ/NeuN表達:模型組大鼠脊髓組織細胞質(zhì)出現(xiàn)很多LC3B染色區(qū)域。假手術(shù)組大鼠脊髓組織細胞質(zhì)幾乎沒有LC3B染色區(qū)域,假手術(shù)組大鼠神經(jīng)根細胞質(zhì)NeuN染色區(qū)域很少。3.免疫組化檢測Caspase3表達:與假手術(shù)組相比,模型組大鼠神經(jīng)根細胞8h、24h、72h時出現(xiàn)較多裂解caspase3陽性染色細胞。4.RT-PCR 法測定組織中 Beclin1、LC3B、PDE2A、NF-KBp65mRNA 水平首先采用標準試劑及方法對定量熒光PCR檢測系統(tǒng)進行了校驗,結(jié)果顯示,實驗系統(tǒng)與理論值的相關(guān)系數(shù)達到0.9978,接近1,表明該實驗系統(tǒng)可以用來準確地檢測基因的mRNA水平。采用該檢測系統(tǒng)檢測LC3B、Beclin 1、PDE2A、NF-κB p65 mRNA水平,結(jié)果顯示:與假手術(shù)組相比,模型組8h、24h、72 h的Beclin 1、LC3B mRNA水平顯著升高。與假手術(shù)組相比,模型組72 h的PDE2A和NF-κB mRNA水平明顯升高。5.Western blotting 測定組織中 Beclin1、LC3B、PDE2A、NF-κB p65 的表達。與假手術(shù)組比,模型組8h、24h、72h的Beclin1、LC3B蛋白水平顯著升高。與假手術(shù)組比,模型組72 h的PDE2A和NF-κB p65蛋白水平顯著升高。結(jié)論:本研究成功建立了化學性神經(jīng)根炎大鼠模型,其脊髓組織中出現(xiàn)自噬特征性結(jié)構(gòu),自噬生物標志物(LC3B和Beclin1)表達水平升高,凋亡關(guān)鍵指標裂解Caspase 3在脊髓和神經(jīng)根細胞中的表達升高,凋亡相關(guān)指標PDE2A和NF-κB p65的表達水平也升高。因此,化學性神經(jīng)根炎大鼠脊髓組織及神經(jīng)細胞出現(xiàn)自噬和凋亡增強現(xiàn)象。第二部分醫(yī)用臭氧對神經(jīng)根炎大鼠脊髓組織的自噬和凋亡的影響方法:選取健康清潔級250-300g的Wistar大鼠54只,雌雄不限,隨機分為三組,每組18只:A組為模型組(n=18),即弗氏佐劑致神經(jīng)根炎組(將浸含50ul完全性弗氏佐劑CFA的止血氧化纖維素放在L5背根神經(jīng)節(jié)處)。B組為臭氧治療組(n=18),建模成功后,硬膜外注入30μg/ml臭氧50μ1。C組為對照組(n=18)。即在L5背根神經(jīng)節(jié)處,放置浸含50ul生理鹽水的止血氧化纖維素。建模成功后,模型組和對照組分別給予過濾空氣50μl,連續(xù)3天。在給藥后8h、24h、72 h各組分別取3只大鼠,取脊髓,保留L5背根神經(jīng)節(jié),行透射電鏡觀察、免疫熒光雙標檢測LC3 ⅡI/NeuN表達、免疫組化檢測Caspase3 表達、RT-PCR 法測定組織中 Beclinl、LC3B、PDE2A、NF-κB p65 mRNA 表達水平、Western blotting 測定組織中 Beclin1、LC3B、PDE2A、NF-κB p65的蛋白水平。結(jié)果:1.透射電鏡觀察:手術(shù)造模后,模型組在8 h、1天和3天脊髓組織中發(fā)現(xiàn)一些自噬體,其包含異常結(jié)構(gòu)(如雙膜)和許多細胞器。與模型組比較,臭氧治療組自噬體的數(shù)量明顯減少。2.免疫熒光雙標檢測LC3II/NeuN表達:模型組大鼠脊髓組織出現(xiàn)很多LC3B染色區(qū)域。與模型組比較,臭氧治療組LC3B染色區(qū)域面積明顯降低。而對照組幾乎沒有LC3B染色區(qū)域。同樣,模型組大鼠脊髓組織出現(xiàn)很多NeuN染色區(qū)域。與模型組比較,臭氧治療組NeuN染色區(qū)域面積降低。對照組NeuN染色區(qū)域很少。3.免疫組化檢測Caspase3表達:模型組大鼠脊髓組織8h、24h、72h時出現(xiàn)很多裂解caspase3陽性染色細胞。與模型組比較,臭氧治療組裂解caspase3陽性染色細胞數(shù)明顯降低,幾乎達到對照組大鼠的水平。4.RT-PCR 法測定組織中 Beclin`、LC3B、PDE2A、NF-κB p65mRNA 水平:結(jié)果顯示:與對照組比,模型組8h、24h、72h的Beclinl和LC3BmRNA水平顯著升高。與模型組比,臭氧治療組8h、24h、72 h的Beclin 1和LC3B mRNA水平均明顯降低,然而仍明顯比對照組的高。與對照組相比,模型組72 h的PDE2A和NF-κB p65 mRNA水平顯著升高。與模型組相比,臭氧治療組72 h的PDE2A和NF-κB p65 mRNA水平均明顯降低,然而仍明顯比對照組的高。5.Western blotting 測定組織中 Beclinl、LC3B、PDE2A、NF-κB p65 的表達:Beclin 1蛋白水平:與對照組比,模型組8h、24h、72 h的Beclin 1和LC3B蛋白水平顯著升高。與模型組比,臭氧治療組8h、24h、72h的Beclin1和LC3B蛋白水平均明顯降低,然而仍明顯比對照組的高。與對照組比,模型組72 h的PDE2A和NF-κB p65蛋白水平顯著升高。與模型組比,臭氧治療組72 h的PDE2A和NF-κB p65蛋白水平均明顯降低,然而仍明顯比對照組的高。結(jié)論:本研究成功建立了化學性神經(jīng)根炎大鼠模型。治療濃度3μg/ml的醫(yī)用臭氧治療能顯著抑制炎癥大鼠自噬體的出現(xiàn)及自噬生物標志物(LC3B和Beclin 1)和凋亡關(guān)鍵指標裂解Caspase 3在脊髓組織中的表達。同時,臭氧抑制神經(jīng)根炎大鼠模型中PDE2A和NF-κB p65的過表達。因此,治療濃度30μg/ml的臭氧可抑制自噬,減少細胞凋亡,從而用于治療神經(jīng)根炎。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R741
【部分圖文】：

圖１大鼠神經(jīng)根炎模型造模詳細實驗過程

否則很難溶解。將ＲＮＡ沉淀溶解于適量（２０？５0ｎｌ）的無ＲＮａｓｅ水中。如果ＲＮＡ逡逑沉淀不完全溶解，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０小于或等于１．６。其ＲＮＡ溶液可以用于進一步的逡逑實驗，或－７（ＴＣ保存。采用凝膠電泳檢測提取的ＲＮＡ質(zhì)量（見

１．透射電鏡觀察逡逑通過采用電子顯微鏡觀察胞質(zhì)中的自噬體來研宄神經(jīng)根炎癥大鼠模型脊髓逡逑組織細胞的自噬情況。結(jié)果表明，手術(shù)造模后，８ｈ、２４ｈ、和７２ｈ邋（如圖３）的逡逑脊髓組織細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)一些自噬體，其包含異常結(jié)構(gòu)（如雙膜）和許多細胞器。逡逑３１逡逑

【參考文獻】

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1 毛晶晶;馬漢祥;熊祥生;徐婷婷;陳學新;孟盡海;;大鼠蛛網(wǎng)膜下腔和硬膜外腔阻滯模型的建立[J];寧夏醫(yī)學雜志;2011年10期

本文編號：2811272