第一部分:內(nèi)源性Aggf1在大鼠SAH后的表達目的:探討內(nèi)源性的血管生長因子Aggf1在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血(spontaneous subarachnoid hemorrhage,SAH)后的表達變化。方法:采用動脈穿刺法建立Sprague-Dawley(SD)大鼠SAH模型,并分別在SAH后3 h、6 h、12 h、24 h、72 h斷頭收集出血側(cè)大腦皮質(zhì),用免疫印跡蛋白法(Western blot)檢測內(nèi)源性Aggf1的表達;此外,在SAH后24 h斷頭取出出血側(cè)大腦皮質(zhì),用免疫熒光(immunofluorescence)分別檢測Aggf1在神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞和血管內(nèi)皮細胞的表達。結(jié)果:與對照組比較,Western blot結(jié)果顯示內(nèi)源性Aggf1在SAH后24 h顯著增加,并且在72 h達到高峰;免疫熒光結(jié)果顯示內(nèi)源性Aggf1主要與血管內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的標(biāo)志物共染。結(jié)論:SAH引起內(nèi)源性Aggf1表達增加,此蛋白主要表達于血管內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞。第二部分:外源性rh-Aggf1對SAH后腦損傷和炎癥的作用目的:探討外源性人重組蛋白Aggf1(rh-Aggf1)對SAH后神經(jīng)功能、腦水含量、血腦屏障通透性、神經(jīng)炎癥的影響方法:建立SD大鼠SAH模型,模型建立后1 h,經(jīng)尾靜脈注射rh-Aggf1;此外,在SAH模型建立前48 h經(jīng)側(cè)腦室注射Aggf1 si RNA抑制內(nèi)源性Aggf1的表達。在SAH后24 h采用改良Garcia評分方法和改良Beam Balance評分方法評估大鼠神經(jīng)功能狀況;在SAH后7 d,14 d,21 d,采用步錯實驗(Foot Fault Test)評估大鼠運動和感覺功能;在SAH后21-25 d,采用水迷宮實驗(Morris Water Maze,MWM)評估大鼠長期的空間記憶功能;評估SAH模型出血評分;用干濕法檢測雙側(cè)大腦半球腦水含量;用伊文思藍(Evans Blue,EB)滲透量檢測血腦屏障(Blood Brain Barrier,BBB)的通透性;用Immunofluorescence標(biāo)記髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)檢測中性粒細胞的浸潤;用Western blot檢測TNF-α和IL-1β表達量。結(jié)果:SAH導(dǎo)致改良Garcia和改良Beam Balance分數(shù)降低、腦水含量升高、Evans Blue滲透率增加,促進中性粒細胞浸潤浸潤和TNF-α、IL-1β表達。然而,給予rh-Aggf1治療能顯著地降低神經(jīng)功能評分、腦水含量和Evans Blue滲透量,并能抑制中性粒細胞的浸潤和TNF-α、IL-1β的表達。相反,抑制內(nèi)源性Aggf1表達,加重了腦損傷和神經(jīng)炎癥。此外,在Foot Fault Test中,SAH后大鼠前肢步錯次數(shù)增多,而rh-Aggf1治療能明顯改善大鼠運動協(xié)調(diào)能力;在Water Maze Test中,SAH后大鼠發(fā)現(xiàn)平臺的時間和距離延長,而rh-Aggf1治療后,大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能顯著改善。結(jié)論:外源性rh-Aggf1能改善大鼠SAH后神經(jīng)功能障礙和長期運動協(xié)調(diào)、記憶功能缺損,降低腦水腫和血腦屏障的通透性,抑制中性粒細胞的浸潤,下調(diào)炎癥因子的釋放,從而抑制炎癥反應(yīng)。然而,抑制內(nèi)源性Aggf1加重了腦損傷和神經(jīng)炎癥。第三部分Aggf1通過PI3K/Akt/NF-κB信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用目的:探討外源性rh-Aggf1對大鼠SAH后腦損傷的保護機制是否與PI3K/Akt/NF-κB信號通路有關(guān)。方法:參照第二部分。在大鼠SAH模型建立前30 min,經(jīng)側(cè)腦室注射PI3K特異性抑制劑LY293002;在SAH模型建立后1 h,經(jīng)尾靜脈注射rh-Aggf1。在模型建立后24h,用改良Garcia評分方法和改良Beam Balance評分方法評估大鼠神經(jīng)功能狀況;用干濕法檢測雙側(cè)大腦半球腦水含量;用Western blot檢測Albumin、MPO、PI3K、p-Akt、Akt、VE-cadherin、Occludin、Claudin-5、p-NF-κB p65、NF-κB p65、TNF-α、和IL-1β的表達。結(jié)果:LY294002預(yù)處理能顯著逆轉(zhuǎn)rh-Aggf1治療在神經(jīng)功能、腦水腫的作用;Western blot結(jié)果顯示LY294002明顯逆轉(zhuǎn)rh-Aggf1治療后Albumin滲透和MPO表達。與Vehicle組相比,外源性rh-Aggf1能明顯增加PI3K、p-Akt、VE-cadherin、Occludin、Claudin-5的表達,降低p-NF-κB p65、NF-κB p65、TNF-α、和IL-1β的表達;而LY294002能明顯抵消rh-Aggf1治療后的下游分子改變。結(jié)論:在大鼠SAH后,外源性rh-Aggf1治療能減輕BBB破壞、神經(jīng)炎癥的發(fā)生,從而改善神經(jīng)功能缺損,其神經(jīng)保護功能至少部分與PI3K/Akt/NF-κB信號通路的激活有關(guān)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R743.35
【部分圖文】：

Sham SAH圖 1.1 Sham 組與 SAH 組大體標(biāo)本。Figure 1.1 Representative images in sham and SAH groups.2.2 內(nèi)源性 Aggf1 在 SAH 后腦組織的表達變化Western blot 結(jié)果顯示，相比于 Sham 組，SAH 后 24 h, Aggf1的表達明顯增加，并且在 72 h 達到峰值（圖 1.2）。

Sham SAH.1 Sham 組與 SAH 組大體標(biāo)本。re 1.1 Representative images in sham and SAH groups.性 Aggf1 在 SAH 后腦組織的表達變化tern blot 結(jié)果顯示，相比于 Sham 組，SAH 后 24 h, Ag顯增加，并且在 72 h 達到峰值（圖 1.2）。

圖1.3 SAH后Aggf1的細胞定位。上圖顯示免疫熒光所選區(qū)域；下圖顯示Ag要表達于星形膠質(zhì)細胞（GFAP）、血管內(nèi)皮細胞（vWF）和小膠質(zhì)細胞（Iba-=3, Scale bar=50μm。Figure 1.3 The expression of Aggf1 in neuron, Astrocyte, Endothelium icroglia. Upper panel indicates the location of staining in the brain (small black boolocalization of Aggf1 with Astrocyte (GFAP), Endothelium (vWF, green) icroglia (Iba-1) at 24 h after SAH. Nuclei are stained with DAPI (blue). n=3 per grcale bar=50μm.3 討論本實驗首先在動物呼吸機輔助通氣下，經(jīng)頸內(nèi)動脈穿刺建立 SAH 模型，實果顯示本實驗穿刺模型大鼠出血量相對而言比較穩(wěn)定，血凝塊主要集聚在顳底皮層（Willis 動脈環(huán)區(qū)，與臨床 SAH 具有很大的相似性，具有一定的研究

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本文編號：2810198