【摘要】：【目的】鳥苷酸結合蛋白1(GBP1)為γ-干擾素(IFN-γ)等誘導的大GTP酶,廣泛表達于全身各個器官細胞,在抗病原微生物等多種生物學反應中起重要作用。近期的研究發(fā)現(xiàn)GBP1參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉移等過程,但分子機制尚不明確,在不同腫瘤中的作用也存在差異。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),GBP1可促進人膠質瘤細胞在裸小鼠體內的增殖,但在體外的增殖未見明顯變化。本研究旨在探討GBP1促進膠質瘤增殖的機制�！痉椒ā�1.從Rembrandt數(shù)據(jù)庫中查詢人腦膠質瘤組織中GBP1表達與膠質瘤患者生存期的關系,GBP1表達與CCL2表達的關系。2.采用逆轉錄病毒載體,在膠質瘤細胞U87中過表達GBP1,建立過表達細胞U87-GBP1,對照細胞為U87-LacZ;采用慢病毒載體敲低膠質瘤細胞LN229中GBP1表達,建立低表達細胞LN229-shGBP1,對照細胞為LN229-shN。收集細胞提取RNA和蛋白質,qRT-PCR、Western blot分析細胞中GBP1的mRNA和蛋白質表達,確定過表達或低表達成功。收集細胞培養(yǎng)液于-70℃冰箱中凍存。3.CCK-8分析細胞體外生長變化。4.qRT-PCR和ELISA方法分別檢測膠質瘤細胞和細胞培養(yǎng)上清中趨化因子CCL2的mRNA和蛋白質表達。5.Ficoll分離液分離人外周血單個核細胞(PBMCs),收集其中貼壁培養(yǎng)細胞(主要為單核細胞),用膠質瘤細胞培養(yǎng)液處理單核細胞2d,采用流式細胞術分析人髓源性抑制細胞(MDSCs,即CD11b~+HLA-DR~-細胞)的比例。6.用含抗人CCL2抗體的培養(yǎng)液培養(yǎng)U87-GBP1和LN229-shN細胞,收集培養(yǎng)液處理單核細胞,同上方法分析MDSCs比例。7.分別將5*10~5/10μL U87-GBP1和U87-LacZ細胞接種于Bal B/C裸小鼠顱內致瘤,40d后處死小鼠。分離小鼠移植瘤組織、骨髓和脾臟組織,通過流式細胞儀分析其中小鼠CD11b~+Gr-1~+(MDSCs)比例�！窘Y果】1.數(shù)據(jù)庫查詢結果顯示,人腦膠質瘤組織中GBP1表達與膠質瘤患者生存期呈負相關,與CCL2表達正相關。2.qRT-PCR、Western blot分析過表達或低表達GBP1的膠質瘤細胞中GBP1的mRNA和蛋白質表達變化,結果顯示U87-GBP1細胞中GBP1表達顯著高于對照細胞U87-LacZ,LN229-shGBP1中的GBP1表達明顯低于LN229-shN細胞,表明成功建立過表達和低表達GBP1細胞。3.采用CCK-8方法測定細胞增殖變化。與對照細胞相比,過表達GBP1后U87-GBP1細胞增殖未見明顯變化,低表達GBP1后LN229-shGBP1細胞增殖也未見顯著變化。4.過表達GBP1后,U87-GBP1細胞中CCL2因子的mRNA表達和細胞培養(yǎng)液中CCL2的蛋白表達均明顯升高;低表達GBP1后LN229-shGBP1細胞和細胞培養(yǎng)液中CCL2表達降低。5.用膠質瘤細胞培養(yǎng)液處理人單核細胞后MDSCs比例發(fā)生明顯變化,其中U87-GBP1細胞組高于對照細胞U87-LacZ,LN229-shGBP1細胞組低于LN229-shN細胞。6.用含抗人CCL2抗體的培養(yǎng)液培養(yǎng)U87-GBP1和LN229-shN細胞,收集培養(yǎng)液處理單核細胞,流式細胞術測得其中MDSCs比例均降低。7.將U87-GBP1和U87-LacZ細胞接種于裸小鼠顱內致瘤,荷U87-GBP1小鼠移植瘤明顯大于荷U87-LacZ小鼠,荷U87-GBP1小鼠移植瘤、骨髓和脾臟中MDSCs比例均高于荷U87-LacZ小鼠(P0.05)�！窘Y論】1.過表達GBP1或低表達GBP1未對人腦膠質瘤細胞U87和LN229的體外增殖產生影響。2.膠質瘤患者組織中GBP1與CCL2表達具正相關性;GBP1可促進膠質瘤細胞中趨化因子CCL2的表達。3.膠質瘤細胞可在體外誘導人正常單核細胞獲得MDSCs表型,而通過分泌CCL2作用于單核細胞或許是其中的機制之一。4.小鼠體內實驗結果提示,GBP1可能通過誘導腫瘤微環(huán)境中MDSCs增加形成免疫抑制微環(huán)境,進而促進腫瘤的增殖。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41
【圖文】：

而腫瘤局部產生的趨化因子和生長因子等可以與細胞外基質部分相互作用，使浸潤的免疫細胞重新獲得不同的功能表型，從而引導免疫系統(tǒng)發(fā)生炎癥或抗炎反應。圖. 腦膠質瘤免疫微環(huán)境示意圖[24]。

穩(wěn)定過表達或低表達 GBP1 的膠質瘤細胞CR 和 Western blot 檢測膠質瘤細胞 U87、LN229 中 GBP1 中表達較低，LN229 表達較高。采用逆轉錄病毒載體在 U8過表達細胞 U87-GBP1 中 GBP1 的 mRNA 和蛋白表達明cZ（圖 2A）。采用慢轉錄病毒載體干擾 LN229 細胞中 GBP1229-shGBP1 中 GBP1 mRNA 和蛋白表達明顯低于對照組 表明成功建立了穩(wěn)定過表達或低表達 GBP1 的膠質瘤細胞P1。 1. Rembrandt 數(shù)據(jù)庫檢索結果。A. 與正常腦組織相比，人腦膠質織中 GBP1 表達升高；B. 高表達 GBP1 的膠質瘤患者生存期低于低 GBP1 的患者；C. 膠質瘤組織中 GBP1 與 CCL2 表達具正相關。

表達或低表達 GBP1 的膠質瘤細胞體外增殖未見明顯變化 CCK-8 試劑檢測過表達或敲低 GBP1 表達的 U87 和 LN229 細胞在結果顯示，與對照細胞 U87-LacZ 或 LN229-shN 相比，U87hGBP1 細胞在體外增殖未發(fā)生明顯變化，幾乎呈現(xiàn)出一致的變化趨P1 的表達變化對 U87 和 LN229 細胞的體外增殖未產生顯著影響。 2. qPCR 和 Western blot 檢測膠質瘤細胞 U87 和 LN229 中 GBP1 表達。A. 胞中轉染 GBP1 基因后 U87-GBP1 細胞中 GBP1 mRNA（左）和蛋白（右）高于對照細胞 U87-LacZ。B. 敲低 LN229 細胞中 GBP1 后，LN229-shGBP中 GBP1 mRNA（左）和蛋白（右）表達低于對照細胞 LN229-shN。

【參考文獻】

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1 柳曉蕓;劉妍彤;毛野;杜晶;杜薇;余佳耘;羅敏;桑亞雄;高祥;徐廣超;劉肖肖;邵彬;魏于全;;浸潤T淋巴細胞在腫瘤微環(huán)境中誘導髓系來源的抑制性細胞募集的實驗研究[J];四川大學學報(醫(yī)學版);2015年04期

2 儲以微;;腦膠質瘤免疫微環(huán)境的研究進展[J];中國腫瘤生物治療雜志;2014年05期

本文編號：2803239