【摘要】：【目的】鳥苷酸結(jié)合蛋白1(GBP1)為γ-干擾素(IFN-γ)等誘導(dǎo)的大GTP酶,廣泛表達(dá)于全身各個(gè)器官細(xì)胞,在抗病原微生物等多種生物學(xué)反應(yīng)中起重要作用。近期的研究發(fā)現(xiàn)GBP1參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程,但分子機(jī)制尚不明確,在不同腫瘤中的作用也存在差異。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),GBP1可促進(jìn)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞在裸小鼠體內(nèi)的增殖,但在體外的增殖未見明顯變化。本研究旨在探討GBP1促進(jìn)膠質(zhì)瘤增殖的機(jī)制�！痉椒ā�1.從Rembrandt數(shù)據(jù)庫中查詢?nèi)四X膠質(zhì)瘤組織中GBP1表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者生存期的關(guān)系,GBP1表達(dá)與CCL2表達(dá)的關(guān)系。2.采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中過表達(dá)GBP1,建立過表達(dá)細(xì)胞U87-GBP1,對(duì)照細(xì)胞為U87-LacZ;采用慢病毒載體敲低膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN229中GBP1表達(dá),建立低表達(dá)細(xì)胞LN229-shGBP1,對(duì)照細(xì)胞為L(zhǎng)N229-shN。收集細(xì)胞提取RNA和蛋白質(zhì),qRT-PCR、Western blot分析細(xì)胞中GBP1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá),確定過表達(dá)或低表達(dá)成功。收集細(xì)胞培養(yǎng)液于-70℃冰箱中凍存。3.CCK-8分析細(xì)胞體外生長(zhǎng)變化。4.qRT-PCR和ELISA方法分別檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清中趨化因子CCL2的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。5.Ficoll分離液分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),收集其中貼壁培養(yǎng)細(xì)胞(主要為單核細(xì)胞),用膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液處理單核細(xì)胞2d,采用流式細(xì)胞術(shù)分析人髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs,即CD11b~+HLA-DR~-細(xì)胞)的比例。6.用含抗人CCL2抗體的培養(yǎng)液培養(yǎng)U87-GBP1和LN229-shN細(xì)胞,收集培養(yǎng)液處理單核細(xì)胞,同上方法分析MDSCs比例。7.分別將5*10~5/10μL U87-GBP1和U87-LacZ細(xì)胞接種于Bal B/C裸小鼠顱內(nèi)致瘤,40d后處死小鼠。分離小鼠移植瘤組織、骨髓和脾臟組織,通過流式細(xì)胞儀分析其中小鼠CD11b~+Gr-1~+(MDSCs)比例。【結(jié)果】1.數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)果顯示,人腦膠質(zhì)瘤組織中GBP1表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者生存期呈負(fù)相關(guān),與CCL2表達(dá)正相關(guān)。2.qRT-PCR、Western blot分析過表達(dá)或低表達(dá)GBP1的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GBP1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)變化,結(jié)果顯示U87-GBP1細(xì)胞中GBP1表達(dá)顯著高于對(duì)照細(xì)胞U87-LacZ,LN229-shGBP1中的GBP1表達(dá)明顯低于LN229-shN細(xì)胞,表明成功建立過表達(dá)和低表達(dá)GBP1細(xì)胞。3.采用CCK-8方法測(cè)定細(xì)胞增殖變化。與對(duì)照細(xì)胞相比,過表達(dá)GBP1后U87-GBP1細(xì)胞增殖未見明顯變化,低表達(dá)GBP1后LN229-shGBP1細(xì)胞增殖也未見顯著變化。4.過表達(dá)GBP1后,U87-GBP1細(xì)胞中CCL2因子的mRNA表達(dá)和細(xì)胞培養(yǎng)液中CCL2的蛋白表達(dá)均明顯升高;低表達(dá)GBP1后LN229-shGBP1細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中CCL2表達(dá)降低。5.用膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液處理人單核細(xì)胞后MDSCs比例發(fā)生明顯變化,其中U87-GBP1細(xì)胞組高于對(duì)照細(xì)胞U87-LacZ,LN229-shGBP1細(xì)胞組低于LN229-shN細(xì)胞。6.用含抗人CCL2抗體的培養(yǎng)液培養(yǎng)U87-GBP1和LN229-shN細(xì)胞,收集培養(yǎng)液處理單核細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得其中MDSCs比例均降低。7.將U87-GBP1和U87-LacZ細(xì)胞接種于裸小鼠顱內(nèi)致瘤,荷U87-GBP1小鼠移植瘤明顯大于荷U87-LacZ小鼠,荷U87-GBP1小鼠移植瘤、骨髓和脾臟中MDSCs比例均高于荷U87-LacZ小鼠(P0.05)�！窘Y(jié)論】1.過表達(dá)GBP1或低表達(dá)GBP1未對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和LN229的體外增殖產(chǎn)生影響。2.膠質(zhì)瘤患者組織中GBP1與CCL2表達(dá)具正相關(guān)性;GBP1可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中趨化因子CCL2的表達(dá)。3.膠質(zhì)瘤細(xì)胞可在體外誘導(dǎo)人正常單核細(xì)胞獲得MDSCs表型,而通過分泌CCL2作用于單核細(xì)胞或許是其中的機(jī)制之一。4.小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,GBP1可能通過誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中MDSCs增加形成免疫抑制微環(huán)境,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的增殖。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.41
【圖文】：

而腫瘤局部產(chǎn)生的趨化因子和生長(zhǎng)因子等可以與細(xì)胞外基質(zhì)部分相互作用，使浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞重新獲得不同的功能表型，從而引導(dǎo)免疫系統(tǒng)發(fā)生炎癥或抗炎反應(yīng)。圖. 腦膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境示意圖[24]。

穩(wěn)定過表達(dá)或低表達(dá) GBP1 的膠質(zhì)瘤細(xì)胞CR 和 Western blot 檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U87、LN229 中 GBP1 中表達(dá)較低，LN229 表達(dá)較高。采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在 U8過表達(dá)細(xì)胞 U87-GBP1 中 GBP1 的 mRNA 和蛋白表達(dá)明cZ（圖 2A）。采用慢轉(zhuǎn)錄病毒載體干擾 LN229 細(xì)胞中 GBP1229-shGBP1 中 GBP1 mRNA 和蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組 表明成功建立了穩(wěn)定過表達(dá)或低表達(dá) GBP1 的膠質(zhì)瘤細(xì)胞P1。 1. Rembrandt 數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果。A. 與正常腦組織相比，人腦膠質(zhì)織中 GBP1 表達(dá)升高；B. 高表達(dá) GBP1 的膠質(zhì)瘤患者生存期低于低 GBP1 的患者；C. 膠質(zhì)瘤組織中 GBP1 與 CCL2 表達(dá)具正相關(guān)。

表達(dá)或低表達(dá) GBP1 的膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外增殖未見明顯變化 CCK-8 試劑檢測(cè)過表達(dá)或敲低 GBP1 表達(dá)的 U87 和 LN229 細(xì)胞在結(jié)果顯示，與對(duì)照細(xì)胞 U87-LacZ 或 LN229-shN 相比，U87hGBP1 細(xì)胞在體外增殖未發(fā)生明顯變化，幾乎呈現(xiàn)出一致的變化趨P1 的表達(dá)變化對(duì) U87 和 LN229 細(xì)胞的體外增殖未產(chǎn)生顯著影響。 2. qPCR 和 Western blot 檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U87 和 LN229 中 GBP1 表達(dá)。A. 胞中轉(zhuǎn)染 GBP1 基因后 U87-GBP1 細(xì)胞中 GBP1 mRNA（左）和蛋白（右）高于對(duì)照細(xì)胞 U87-LacZ。B. 敲低 LN229 細(xì)胞中 GBP1 后，LN229-shGBP中 GBP1 mRNA（左）和蛋白（右）表達(dá)低于對(duì)照細(xì)胞 LN229-shN。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 柳曉蕓;劉妍彤;毛野;杜晶;杜薇;余佳耘;羅敏;桑亞雄;高祥;徐廣超;劉肖肖;邵彬;魏于全;;浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中誘導(dǎo)髓系來源的抑制性細(xì)胞募集的實(shí)驗(yàn)研究[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2015年04期

2 儲(chǔ)以微;;腦膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境的研究進(jìn)展[J];中國(guó)腫瘤生物治療雜志;2014年05期

本文編號(hào)：2803239