【摘要】：膠質(zhì)母細胞瘤(Glioblastoma,GBM)是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤,預后不良。目前的標準治療包括腫瘤的最大安全切除,同步放化療和隨后的替莫唑胺序貫化治療。盡管針對GBM的靶向治療和免疫治療已取得初步進展,然而GBM患者的中位生存期僅為14.6個月。膠質(zhì)瘤干細胞,又稱膠質(zhì)瘤起始細胞(glioma initiating cells,GICs),具有自我更新、無限增殖、多潛能分化和強致瘤能力,與GBM對化療和放療的抗性密切相關(guān)。Notch通路在維持GIC自我更新和致瘤性方面擔當很重要的角色。當Notch通路高度活化時,GIC得以維持自身干性表型。盡管在治療早期,靶向Notch通路的治療被發(fā)現(xiàn)能夠抑制低氧腫瘤微環(huán)境的形成并促進腫瘤細胞凋亡,但對經(jīng)歷長期治療的GBM患者卻無明顯益處。這可能是由于單靶點抑制Notch通路是不夠的,GIC可以借助其他潛在通路激活維持生存。因此,本研究將討論Notch通路治療的新機制。自噬是一種進化上保守的依賴溶酶體的生物學行為,能夠促進長壽命蛋白質(zhì)和功能障礙細胞器的降解,并有助于細胞新陳代謝。在癌癥中,自噬具有關(guān)鍵作用,因為它可以阻止腫瘤進展。最近,自噬已被證明可促進GICs的分化和減弱自我更新。然而,自噬如何調(diào)控GICs的自我更新和致瘤性還不是很清楚。在本研究中,我們評估了GIC維持自我更新背景下,自噬和Notch1通路之間的關(guān)系。我們首次發(fā)現(xiàn)自噬抑制GIC自我更新和致瘤性,并證實Notch1通路與GIC自我更新之間的直接關(guān)系。此外,我們的數(shù)據(jù)顯示,自噬通過上調(diào)Notch1降解來抑制Notch1通路的活化。因此,自噬誘導的Notch1降解可能是阻止GBM進展的有前景的治療策略。本課題主要研究自噬在GICs維持自我更新和致瘤性中的作用及其潛在機制,研究分為三個部分:1、CD133+的膠質(zhì)瘤細胞的分離篩選和鑒定。為了研究GIC干性維持的機制,我們在體外建立了CD133+膠質(zhì)瘤細胞模型:利用CD133免疫磁珠分選試劑盒(MACS)篩選得到CD133+的U87和U251膠質(zhì)瘤細胞,用流式細胞術(shù)以量化MACS篩選的CD133+細胞以確認分選的有效性;選擇CD133和Nestin作為標記以評估GIC干性;基于NICD和靶基因Hes1的表達來評估Notch1通路活化。通過星形細胞標志物,膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達來評估細胞分化。實驗結(jié)果顯示,MACS后CD133+的膠質(zhì)瘤細胞陽性率較高;CD133+的膠質(zhì)瘤細胞Nestin,CD133,Notch1,NICD呈陽性表達;CD133+細胞在干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)并形成細胞球,而不根據(jù)CD133陽性分選的細胞在相同培養(yǎng)條件下不能發(fā)育出球體。2、抑制mTOR通路誘發(fā)自噬,降低GICs的自我更新能力。選擇2種經(jīng)典的mTOR通路抑制劑AZD8055和Rapamycin,檢測其對GIC存活率的影響。通過Western Blot和免疫熒光染色,檢測GIC經(jīng)AZD8055和Rapamycin處理后mTOR通路相關(guān)蛋白mTOR,p-mTOR,Akt,p-Akt和自噬相關(guān)蛋白p62,LC3B的表達情況。經(jīng)AZD8055和Rapamycin處理后,通過極限稀釋實驗、成球?qū)嶒�、增殖實�?檢測GIC自我更新和增殖能力;使用AZD8055+3-MA組合來證實自噬對GIC自我更新的直接抑制;并通過Western Blot和免疫熒光染色檢測干性相關(guān)蛋白Nestin,CD133和分化蛋白GFAP的表達情況。實驗結(jié)果顯示,用不同濃度的AZD8055和rapamycin處理不同的時間,GIC細胞活力降低;AZD8055和rapamycin可以抑制mTOR通路并誘發(fā)自噬,Nestin和CD133表達降低,GFAP表達增高,且各濃度組之間的蛋白表達差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。隨藥物濃度增高,GIC自我更新能力隨之下降;GIC各組成球數(shù)目和細胞球體積遞減。加藥后,GIC增殖能力降低;上述結(jié)果差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3、自噬抑制Notch1通路的活化及GIC的致瘤性。首先檢測自噬對Notch1通路表達的影響。經(jīng)AZD8055和Rapamycin處理后,Notch1通路相關(guān)蛋白Notch1,NICD,Hes1的表達被檢測。實驗結(jié)果提示,Notch1通路相關(guān)蛋白的表達隨藥物濃度增高而降低,且各濃度組蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。進一步的研究表明,自噬調(diào)節(jié)Notch1的降解。經(jīng)AZD8055和Rapamycin處理后,用Western Blot檢測GIC的胞膜Notch1的表達情況。用免疫熒光染色檢測胞內(nèi)Notch1和LC3B的共定位情況。實驗結(jié)果顯示,GIC胞膜Notch1表達降低,Dll1表達不變,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。在GIC中Notch1和LC3B在胞內(nèi)存在共定位關(guān)系。進一步,為了研究AZD8055和rapamycin對GIC致瘤性的潛在作用,U87GICs被植入腦中產(chǎn)生顱內(nèi)原位異種移植模型。種植7天后,每周五天腹膜內(nèi)注射DMSO,AZD8055或rapamycin持續(xù)3周。生物發(fā)光成像和HE染色顯示,AZD8055和rapamycin組的GIC致瘤性低于DMSO組;特別是經(jīng)AZD8055治療比rapamycin治療腫瘤體積更小。AZD8055和rapamycin處理的小鼠比DMSO處理的小鼠存活時間更長,其中經(jīng)AZD8055處理的小鼠在組群中具有更長的存活期。這些結(jié)果表明AZD8055和rapamycin誘導的自噬抑制了體內(nèi)U87 GICs的致瘤性。結(jié)論:1.抑制mTOR通路能夠誘發(fā)自噬,并降低GICs的自我更新能力;2.自噬抑制Notch1通路的活化;3.自噬對Notch1通路活性的抑制是通過自噬囊泡吞噬并降解Notch1發(fā)生的;4.在體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)誘發(fā)自噬可以抑制GICs的致瘤性。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41
【圖文】：

圖 1.1 如圖所示：一種干細胞球的免疫熒光染色裝置，左側(cè)包括 1.5mL 的 EP (eppendorf) 管2，所述 1.5mL EP 管 2 是實驗室常用的離心管，由塑料制成。包括修剪后的 200μL 離心管 1，將所述 200μL 離心管 1 管蓋沿著邊緣裁剪，使其能夠放入 1.5mL EP 管 2 中。還包括一個泡沫塞 3，用于在 1.5mL EP 管 2 中填補空隙。1.1.3.6.2 實驗步驟（1）收集細胞球于 15mL 的離心管中；（2）加入 1mL PBS,用 200μL 量程的移液槍輕輕的吹打細胞球后離心，離心速度為 800g/min，離心 5 分鐘，去上清；（3）重復 b 步驟兩次，去除干細胞培養(yǎng)基對細胞球的影響；（4）加入 1mL 4%的多聚甲醛，重懸細胞球 10 分鐘，每隔 3 分鐘用 200μL 量程的移液槍輕輕的吹打細胞球，以求細胞球與 4%的多聚甲醛充分接觸；（5）加入 1mL 0.4%的 Triton X-100 通透細胞，后重復步驟 d；（6）重復 b 步驟兩次，去除干細胞培養(yǎng)基對細胞球的影響；

圖 1.2 免疫磁珠篩選（MACS）CD133+的膠質(zhì)瘤細胞并形成細胞球。A. 流式細胞術(shù)以量化MACS +群體中的 CD133 +細胞，檢測 CD133+細胞百分比，篩選前后 U87 細胞系中 CD133+細胞百分比分別為 6.65±0.6％和 87.64±4.09％，U251 細胞系為 5.98±0.93％和 76.93±3.59％。B. CD133 +細胞在干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng) 7 天并形成懸浮細胞球，未在 CD133 陽性的基礎上分選的細胞在相同培養(yǎng)條件下不能培養(yǎng)出細胞球。1.2.2 Western Blot 檢測 CD133+細胞蛋白表達為了進一步證實篩選 CD133+細胞的干性表型，我們采用 Western Blot 檢測CD133 和 Nestin 作為標記以評估；并基于 NICD 和靶基因 Hes1 的表達來評估Notch1 通路的活化；通過星形膠質(zhì)細胞標志物，膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的表達來評估細胞分化。Western Blot 結(jié)果顯示，CD133 +神經(jīng)球的干細胞標志物（CD133 和 Nestin），Notch1 和活化的 Notch1 通路相關(guān)蛋白（NICD 和 Hes1）的表達高于 MACS 篩選前的細胞；此外，CD133 +神經(jīng)球中 GFAP 的表達減少（圖 1.3）。這些結(jié)果顯示體外培養(yǎng)的 CD133+細胞球富集 GIC 并維持其干性表

stern Blot 檢測 CD133+細胞蛋白表達。CD133+的 U87 和 U251 細胞系細鐵壁生長的普通細胞，高表達干性標志物 CD133 和 Nestin，低表達且伴 Notch1 通路高度活化（NICD 和 Hes1）。GAPDH 為內(nèi)參。疫熒光染色檢測 CD133+細胞蛋白表達部分實驗中，在蛋白水平上，我們進一步用免疫熒光染色確定表達的結(jié)果，對 CD133+的 U87 和 U251 細胞系細胞球進行免發(fā)現(xiàn)，CD133+細胞球高表達 CD133，Nestin，Notch1 和 NIC CD133+的膠質(zhì)瘤細胞能夠維持自身干性表型，并伴 Notch1

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本文編號：2801531