發(fā)布時間：2020-08-15 23:11

【摘要】：目的:1.檢測乙硫氨酸腹腔注射C57BL/6孕鼠是否可以引起胎鼠神經(jīng)管畸形(neural tube defects,NTD_S)的發(fā)生。2.從C57小鼠中提取原代神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs),并進行培養(yǎng)、鑒定,為研究乙硫氨酸引起神經(jīng)管畸形的研究提供細胞模型。3.通過研究乙硫氨酸對神經(jīng)干細胞功能的影響,初步研究乙硫氨酸在其引起的C57BL/6小鼠胚胎神經(jīng)管畸形發(fā)生過程中的作用。方法:1.通過腹腔注射的方式,將乙硫氨酸以100 mg/kg的劑量注入到C57BL/6懷孕第7.5天(E7.5)母鼠體內(nèi),然后繼續(xù)飼養(yǎng)至E9.5、E10.5和E11.5時分別提取分離出完整的胚胎,通過體視顯微鏡及HE染色的方法觀察及檢測E10.5和E11.5時胚胎的前腦、后腦的閉合情況,對造模的結果進行驗證。2.從孕E13.5天的C57胎鼠腦組織中,通過機械法提取原代NSCs,然后用懸浮細胞培養(yǎng)法進行體外培養(yǎng);用免疫熒光染色法通過檢測NSCs的Nestin特征蛋白來初步鑒定NSCs;然后再次用免疫熒光染色法檢測其分化后神經(jīng)元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的特征蛋白來進行進一步的NSCs分化鑒定。3.將乙硫氨酸加入到神經(jīng)干細胞的增殖培養(yǎng)基中,將實驗分為兩組:對照組(正常培養(yǎng)的NSC組)、實驗組(加乙硫氨酸培養(yǎng)的NSC組),兩組細胞各培養(yǎng)一段時間,在熒光顯微鏡下觀察其細胞形態(tài)并攝片,在Image-J軟件下,隨機選取每組5-10個不同的視野進行神經(jīng)球的計數(shù)并用GraphPad Prism 5軟件分析作圖,以此觀察其集落形成能力、神經(jīng)球的形成比例以及細胞的生長狀態(tài),初步推斷乙硫氨酸對神經(jīng)干細胞的增殖的影響。4.通過Cell Counting Kit-8法(CCK-8法)檢測實驗組和對照組的細胞增殖變化情況;5.通過流式細胞術檢測實驗組和對照組的細胞凋亡的變化情況。6.通過Western blotting蛋白印跡法法檢測Caspase 3蛋白表達變化。7.通過流式細胞術檢測實驗組和對照組的細胞周期的變化情況。8.通過免疫熒光的方法檢測實驗組和對照組兩組分化情況的差異。9.統(tǒng)計學分析方法:數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(X±S)表示,統(tǒng)計學分析采用SPSS17.0軟件,兩個樣本均數(shù)間差異采用t檢驗,多個樣本均數(shù)采用方差分析,*表示P0.05,**表示P0.01,***表示P0.001,當P0.05時可認為差異具有統(tǒng)計學意義。數(shù)據(jù)作圖使用GraphPad Prism 5軟件以及Image-J灰度值分析軟件。結果:1.乙硫氨酸腹腔注射懷孕E7.5的C57BL/6孕鼠,成功誘導出小鼠NTDs,最佳致劑量為100 mg/kg,NTDs發(fā)生率為54.7%,小鼠NTDs主要表現(xiàn)為顱面畸形和發(fā)育遲緩,其它畸形有后腦神經(jīng)管未閉、前腦發(fā)育不足等;HE染色可見神經(jīng)管畸形胎鼠前后腦泡未閉合,結構異常。2.原代提取的NSCs生長狀態(tài)良好。Nestin免疫熒光染色呈陽性;NSCs分化為神經(jīng)元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的特征性蛋白NF-H、MAP2、GFAP和GALC,結果也均呈陽性顯色。3.實驗組和對照組在集落形成能力和神經(jīng)球的形成比例上均有差異,最佳添加濃度為10 mmol/L;對照組集落形成能力顯著高于實驗組,差異具有統(tǒng)計學意義(12.60±1.074 vs.5.50±0.893,t=10.80,P0.05)。實驗組直徑小于100μm的神經(jīng)球的數(shù)量雖比對照組的多,但對照組在直徑大于100μm的神經(jīng)球的數(shù)量上的遠多于實驗組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.CCK-8法結果得出:實驗組0 h時的吸光度值(OD)與對照組無明顯差異,而接下來的1-5天的OD值,實驗組則顯著低于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(1d:t=7.227,P=0.0019;2d:t=8.855,P=0.0009;3d:t=15.95,P0.0001;4d:t=31.83,P0.0001;5d:t=9.017,P=0.0008)。表明乙硫氨酸顯著降低了NSCs的增殖能力,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.流式結果顯示:早凋率和晚凋率的變化與時間成正比例關系,隨著NSC_S體外給予乙硫氨酸干預時間的延長,早凋率和晚凋率都逐漸升高,總凋亡率也隨著NSC_S體外給予乙硫氨酸干預時間的延長逐漸升高,差異有統(tǒng)計學意義。(總凋亡0 h vs.72h:P=0.0037,總凋亡48 h vs.72 h:P=0.0141,總凋亡0 h vs.48 h:P=0.0084)。6.Western blotting法顯示,在Caspase3蛋白表達量上,實驗組比對照組高,P0.01,差異有統(tǒng)計學意義。7.流式結果顯示:處于G1期的細胞數(shù),實驗組顯著高于對照組(P0.0001),而處于S和G2期的細胞數(shù),實驗組顯著低于對照組(P_S=0.0002,P_(G2)=0.0021),差異具有統(tǒng)計學意義。實驗組的細胞被捕獲在了G1期,無法進入S期。8.免疫熒光結果顯示:實驗組向神經(jīng)元、星形膠質細胞、少突膠質細胞分化的能力都低于對照組。結論:1.乙硫氨酸腹腔注射可引起C57BL/6胎鼠NTD_S,提示葉酸的甲硫氨酸循環(huán)代謝障礙與NTD_S發(fā)育有關,且此模型的建立為后續(xù)研究甲硫氨酸循環(huán)障礙與NTD_S的關系即乙硫氨酸在NTD_S中的作用提供了動物模型依據(jù)。2.經(jīng)過一系列的提取、培養(yǎng)、鑒定,成功的為后面的實驗提供了可靠的細胞模型。3.通過研究乙硫氨酸對神經(jīng)干細胞的細胞功能的影響,初步表明乙硫氨酸可能通過引起神經(jīng)干細胞的增殖減少,凋亡增多及干擾神經(jīng)干細胞的分化功能在引起C57BL/6小鼠胚胎神經(jīng)管畸形的發(fā)生過程中發(fā)揮了一定的作用。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R748
【圖文】：

圖 1-2 E10.5 胎鼠及 HE 染色圖圖 1-2：E10.5 胎鼠 HE 染色圖。A：E10.5 正常胎鼠（×4）；B：A 圖對應的腦部 HE 染色圖（×25C：A 圖對應的前腦 HE 染色圖（×48）；D：A 圖對應的后腦 HE 染色圖（×48）；E:E10.5 畸胎鼠（×48）；F：B 圖對應的腦部全胚胎染色圖（×25）；G：B 圖對應的前腦 HE 染色圖（×48H：B 圖對應的后腦 HE 染色圖（×48）

圖 1-2 E10.5 胎鼠及 HE 染色圖圖 1-2：E10.5 胎鼠 HE 染色圖。A：E10.5 正常胎鼠（×4）；B：A 圖對應的腦部 HE 染色圖（×25）；C：A 圖對應的前腦 HE 染色圖（×48）；D：A 圖對應的后腦 HE 染色圖（×48）；E:E10.5 畸形胎鼠（×48）；F：B 圖對應的腦部全胚胎染色圖（×25）；G：B 圖對應的前腦 HE 染色圖（×48）；H：B 圖對應的后腦 HE 染色圖（×48）

圖 2-1 顯微鏡下提取 NSCs 過程（×40）小鼠雙側子宮取出的串珠狀子宮；B：剝離了蛻膜組織的完整胎鼠離顱骨暴露出的腦組織；D：剝離腦膜后底面觀察到的完整腦組織胞培養(yǎng)時的形態(tài)學觀察 NSCs 細胞初時呈圓形，體積較小，胞體透明，折光性強 A）。經(jīng)兩三天的培養(yǎng)，圓形細胞的體積逐漸增大，6-10成啞鈴狀，細胞形態(tài)慢慢變圓，細胞球雖不大，但開始形成（胞純度高，狀態(tài)好，增殖快，形成的細胞球數(shù)量越來越多成較大細胞球（圖 2-2 C）。由于球體中心部比較膨隆立代以后有些大的細胞球因為緊緊形成一個獨立體，營養(yǎng)無態(tài)變差（圖 2-2 D）。

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本文編號：2794794