【摘要】：目的:人腦膠質(zhì)瘤來源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見的原發(fā)腫瘤,惡性程度較高,往往可迅速擴散至遠(yuǎn)離原發(fā)灶的腦組織,且與周圍腦組織浸潤程度深,故手術(shù)很難將膠質(zhì)瘤組織完全切除。目前,全世界范圍內(nèi)的膠質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)治療方法為,手術(shù)切除,術(shù)后加以同步放化療等綜合治療方法。在最新的世界衛(wèi)生組織(WHO)關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分類(2016)中首次將分子生物標(biāo)記與典型的組織學(xué)特征結(jié)合起來,以定義不同的神經(jīng)膠質(zhì)瘤?新的神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷方法間接說明了對腦腫瘤生物學(xué)行為理解更深了一層?同時,膠質(zhì)瘤患者個體化治療被越來越重視,可能成為今后膠質(zhì)瘤治療的突破口。WNK蛋白激酶家族由四個成員組成,WNK1、WNK2、WNK3和WNK4,其特征在于保守催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)的典型序列變異,因其功能結(jié)構(gòu)域上缺乏賴氨酸而得名。盡管大多數(shù)研究都集中在WNK1,WNK3和WNK4在調(diào)節(jié)腎臟和腎外組織中不同離子轉(zhuǎn)運蛋白中的作用,但越來越多的證據(jù)表明WNK激酶在與癌癥相關(guān)的各種信號級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮作用,它們在G1/S細(xì)胞周期進(jìn)展、代謝性腫瘤細(xì)胞適應(yīng)、逃避凋亡和轉(zhuǎn)移中均發(fā)揮作用。然而,WNK在膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬表型相關(guān)研究尚屬空白。研究方法:在實驗中,我們首先利用免疫組化檢測到了WNK3在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況,同時也采用Western blot方法檢測了WNK3在三種實驗常用人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251、U373的表達(dá)程度。隨后,我們構(gòu)建相關(guān)質(zhì)粒進(jìn)行“瞬轉(zhuǎn)”,以達(dá)到干擾WNK3基因在U87細(xì)胞系中的表達(dá)的目的,并使用Western blot方法進(jìn)行檢驗,觀察WNK3基因是否下調(diào)。接著,我們使用WNK3干擾的U87細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞學(xué)功能學(xué)實驗操作。使用CCK-8方法檢測相同濃度的TMZ作用于不同組別,觀察細(xì)胞存活率是否有明顯差異。同時使用Western blot檢測各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B,P62,Beclin1。最后,使用透射電鏡觀測經(jīng)替莫唑胺處理后的不同組別的膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果:實驗結(jié)果顯示,WNK3基因在U87、U251、U373三種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中均有高低程度不同地表達(dá)。同時,在醫(yī)院收集到的膠質(zhì)瘤標(biāo)本中,我們發(fā)現(xiàn)WNK3基因在高級別膠質(zhì)瘤(GradeIII-IV)中的表達(dá)程度高于在低級別膠質(zhì)瘤(Grade I-II)。通過WB方法檢測,WNK3干擾后,經(jīng)過替莫唑胺處理U87的細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白較陰性對照的表達(dá)量低。另外,在TMZ的作用下,經(jīng)CCK-8實驗測得在0、24、36、48h細(xì)胞存活率,發(fā)現(xiàn)在WNK3干擾的U87細(xì)胞活性低于正常的U87細(xì)胞。我們還發(fā)現(xiàn),經(jīng)過替莫唑胺作用后的shRNA-WNK3 U87細(xì)胞,通過透射電子顯微鏡所見的雙層膜結(jié)構(gòu)及內(nèi)含殘余細(xì)胞器的自噬體和空泡單膜的自噬溶酶體較陰性對照組少。結(jié)論:以上實驗結(jié)果表明WNK3干擾可減少替莫唑胺作用下膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生的自噬作用,可能通過自噬表型的改變來調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤對化療藥物替莫唑胺的耐藥性,可能是未來膠質(zhì)瘤治療方向中的作用靶點。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.4
【圖文】：

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圖 2 經(jīng)質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)后，成功構(gòu)建出 shRNA-WNK3 U87 細(xì)胞系，WNK3 表達(dá)量與對照組相比有明顯降低3.3 CCK-8 法檢測 WNK3 聯(lián)合不同劑量替莫唑胺對 U87 增殖的影響為了探究 WNK3 對 U87 細(xì)胞化療敏感性的是否有增強作用，我們采用不濃度梯度的 TMZ 進(jìn)行 CCK-8 實驗。WNK3 轉(zhuǎn)染 U87 和質(zhì)�？辙D(zhuǎn)的 U87 細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后8小時換全新含有不同劑量的TMZ ( 0, 50, 100, 200, 400uM)的DMEM培養(yǎng)基，作用時長達(dá) 24 小時，利用 CCK-8 法進(jìn)行檢測細(xì)胞活性，公式：細(xì)胞活性=[(試驗孔吸光度-空白組吸光度) / (對照組吸光度-空白組吸光度)]*100%。CCK-8 結(jié)果顯示(圖 3), 空轉(zhuǎn)+TMZ 組及 WNK3 干擾+TMZ 組劑量依賴性地抑制了 U87 細(xì)胞活性。同時，相比于對照組，WNK3 干擾組中 TMZ 誘導(dǎo)細(xì)胞活性明顯低于空轉(zhuǎn)對照組。證明了轉(zhuǎn)染 WNK3 后，可大大增強 TMZ 對膠質(zhì)瘤 U87細(xì)胞增殖抑制作用。

圖 2 經(jīng)質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)后，成功構(gòu)建出 shRNA-WNK3 U87 細(xì)胞系，WNK3 表達(dá)量與對照組相比有明顯降低3.3 CCK-8 法檢測 WNK3 聯(lián)合不同劑量替莫唑胺對 U87 增殖的影響為了探究 WNK3 對 U87 細(xì)胞化療敏感性的是否有增強作用，我們采用不濃度梯度的 TMZ 進(jìn)行 CCK-8 實驗。WNK3 轉(zhuǎn)染 U87 和質(zhì)�？辙D(zhuǎn)的 U87 細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后8小時換全新含有不同劑量的TMZ ( 0, 50, 100, 200, 400uM)的DMEM培養(yǎng)基，作用時長達(dá) 24 小時，利用 CCK-8 法進(jìn)行檢測細(xì)胞活性，公式：細(xì)胞活性=[(試驗孔吸光度-空白組吸光度) / (對照組吸光度-空白組吸光度)]*100%。CCK-8 結(jié)果顯示(圖 3), 空轉(zhuǎn)+TMZ 組及 WNK3 干擾+TMZ 組劑量依賴性地抑制了 U87 細(xì)胞活性。同時，相比于對照組，WNK3 干擾組中 TMZ 誘導(dǎo)細(xì)胞活性明顯低于空轉(zhuǎn)對照組。證明了轉(zhuǎn)染 WNK3 后，可大大增強 TMZ 對膠質(zhì)瘤 U87細(xì)胞增殖抑制作用。

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本文編號：2793548