【摘要】：神經(jīng)退行性疾病(例如:阿爾茨海默癥、帕金森病、癲癇等)嚴(yán)重危害人類健康與生命,目前該類疾病的治療仍是一個(gè)世界性的醫(yī)學(xué)難題。在我國(guó),由于人口基數(shù)大,老齡化加劇等因素,神經(jīng)退行性疾病患者數(shù)量加速增加,造成了嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,研究干預(yù)與治療神經(jīng)退行性疾病的新技術(shù)具有重要意義。近些年,超聲輻射力作為一種新型無(wú)創(chuàng)神經(jīng)調(diào)控技術(shù)被提出。與傳統(tǒng)的電極刺激、磁刺激、光遺傳學(xué)等神經(jīng)調(diào)控技術(shù)相比,超聲輻射力具備無(wú)創(chuàng)刺激、多點(diǎn)刺激、深部刺激的特點(diǎn)。但是,目前許多超聲輻射力神經(jīng)生物效應(yīng)尚不明確,本論文從三方面研究經(jīng)顱超聲輻射力刺激引起的神經(jīng)生物學(xué)效應(yīng):(1)經(jīng)顱超聲輻射力刺激對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)元突觸可塑性的影響;(2)經(jīng)顱超聲輻射力刺激對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)元初級(jí)纖毛的影響;(3)經(jīng)顱超聲輻射力刺激對(duì)神經(jīng)元自噬水平的影響。(1)背景:神經(jīng)突觸可塑性包括了功能與結(jié)構(gòu)可塑性兩個(gè)方面。以往研究證實(shí),海馬區(qū)神經(jīng)元的突觸可塑性與記憶功、學(xué)習(xí)、認(rèn)知能力等密切相關(guān),并在神經(jīng)退行性病的發(fā)生與發(fā)展中扮演重要角色。但是,目前經(jīng)顱超聲輻射力刺激對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)與功能可塑性的影響并不清楚。目的:本論文研究經(jīng)顱超聲輻射力刺激能否調(diào)控神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)與功能可塑性。方法:利用經(jīng)顱超聲輻射力(換能器頻率:0.5 MHz,脈沖重復(fù)頻率:500 Hz,占空比:5%,聲壓:0.42MPa,超聲空間峰值時(shí)間平均強(qiáng)度ISPTA:360 mW/cm2,空間峰值脈沖平均強(qiáng)度ISPPA:7.2W/cm2)對(duì)大鼠(對(duì)照組:n = 22,超聲組:n = 22)刺激10天(10分鐘/天)。利用高爾基染色評(píng)價(jià)神經(jīng)元微結(jié)構(gòu)樹(shù)突棘的變化、利用離體膜片鉗電生理技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元興奮性突觸后電流、利用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)離子通道型谷氨酸受體(G1uN2A,G1uN2B與G1uR1亞型)的表達(dá)、利用HE染色與尼氏染色評(píng)價(jià)經(jīng)顱超聲輻射力刺激安全性。結(jié)果:經(jīng)顱超聲輻射力刺激顯著提高了海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)元樹(shù)突棘密度(對(duì)照組:0.72 ± 0.17個(gè)/μm,超聲組:0.94 ±0.19個(gè)/μm;p0.01)與興奮性突觸后電流的發(fā)放頻率(對(duì)照組:0.37±0.14 Hz,超聲組:1.77 ±0.37 Hz;p0.01),并且提高海馬區(qū)離子通道型谷氨酸受體G1uN2A亞型的表達(dá)(p0.05)。HE染色與尼氏染色結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,經(jīng)顱超聲輻射力刺激并未在皮層、海馬區(qū)引發(fā)腦出血、組織損毀、神經(jīng)元丟失等異�，F(xiàn)象。結(jié)論:經(jīng)顱超聲輻射力刺激是一種調(diào)控神經(jīng)元結(jié)構(gòu)可塑性、功能可塑性、以及谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)受體表達(dá)的可行技術(shù)。(2)背景:初級(jí)纖毛是一個(gè)位于細(xì)胞表面的細(xì)胞感受器,能夠感知環(huán)境各種物理與化學(xué)信號(hào),并將信號(hào)傳導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),從而調(diào)整細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。神經(jīng)元初級(jí)纖毛與大腦發(fā)育、功能和疾病密切相關(guān)。目前,尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道超聲輻射力對(duì)神經(jīng)元初級(jí)纖毛的影響。目的:本論文研究經(jīng)顱超聲輻射力刺激能否調(diào)控神經(jīng)元的初級(jí)纖毛。方法:細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,利用不同參數(shù)超聲輻射力刺激原代神經(jīng)元(換能器頻率:0.68 MHz,脈沖重復(fù)頻率:500 Hz,占空比:5%,超聲強(qiáng)度ISPTA:65mW/cm2或210mW/cm2,刺激時(shí)間:3小時(shí)或6小時(shí))。利用免疫熒光染色評(píng)價(jià)超聲輻射力刺激對(duì)原代神經(jīng)元初級(jí)纖毛的影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,利用經(jīng)顱超聲輻射力(換能器頻率:0.5 MHz,脈沖重復(fù)頻率:500Hz,占空比:5%,聲壓:0.42MPa,超聲強(qiáng)度ISPTA:360mW/cm2,超聲強(qiáng)度 ISPA:7.2W/cm2)對(duì)大鼠(對(duì)照組:n= 10,超聲組:n= 10)刺激10天(10分鐘/天)。利用免疫熒光染色觀察海馬神經(jīng)元初級(jí)纖毛,利用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)纖毛相關(guān)ACIII蛋白的表達(dá)。結(jié)果:細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,利用強(qiáng)度ISPTA為65 mW/cm2的超聲對(duì)原代神經(jīng)元刺激3小時(shí)與6小時(shí)后,均顯著性降低原代神經(jīng)元初級(jí)纖毛的發(fā)生率(對(duì)照組:61.8%± 6.0%,3小時(shí)超聲組32.6%± 13.5%,6小時(shí)超聲組:12.1%±6.4%,p0.01),與減短初級(jí)纖毛的長(zhǎng)度(對(duì)照組:4.2 ± 1.1,3小時(shí)超聲組3.0±1.1μm,6 小時(shí)超聲組:2.2±1.1μm,p0.01)。利用強(qiáng)度 ISPTA 為 65mW/cm2或210 mW/cm2的超聲對(duì)神經(jīng)元連續(xù)刺激3小時(shí),均顯著性降低原代神經(jīng)元初級(jí)纖毛的發(fā)生率(對(duì)照組:68.5%±12.7%,65 mW/cm2超聲組:30.4%±3.9%,210 mW/cm2超聲組:9.3%±5.2%,p0.01),與減短初級(jí)纖毛的長(zhǎng)度(對(duì)照組:4.2 ± 1.3 μm,65 mW/cm2 超聲組 3.1 ± 1.3 μm,210 mW/cm2 超聲組:2.3 ±1.1μm,p0.01)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)顱超聲輻射力刺激顯著降低海馬CA1區(qū)神經(jīng)元初級(jí)纖毛的發(fā)生率(對(duì)照組:35.1%± 6.6%,超聲組28.9%± 4.6%,p0.05),與減短初級(jí)纖毛的長(zhǎng)度(對(duì)照組:35.1%± 6.6%,超聲組:28.9%±4.6%,p0.05)。另外,蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,超聲輻射力刺激顯著降低了海馬區(qū)ACⅢ蛋白的表達(dá)(p0.05)量。結(jié)論:超聲輻射力刺激能有效調(diào)控神經(jīng)元初級(jí)纖毛,具備干預(yù)初級(jí)纖毛相關(guān)腦疾病的潛能。(3)背景:自噬是一種細(xì)胞自身清理異常蛋白、損傷細(xì)胞器、維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的保護(hù)機(jī)制,普遍存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,被稱為Ⅱ型細(xì)胞死亡。研究證實(shí),神經(jīng)元自噬在阿爾茨海默癥,帕金森癥等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生與發(fā)展中起著至關(guān)重要作用。目前,尚未有文獻(xiàn)報(bào)道超聲輻射力刺激對(duì)神經(jīng)元自噬水平的影響。目的:本論文研究經(jīng)顱超聲輻射力刺激能否調(diào)控神經(jīng)元的自噬水平。方法:細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,利用不同參數(shù)超聲輻射力刺激原代神經(jīng)元(換能器頻率:0.68 MHz,脈沖重復(fù)頻率:500 Hz,占空比:5%,超聲輻射力刺激1秒,停止1秒,超聲強(qiáng)度ISPTA:70 mW/cm2或165 mW/cm2,刺激時(shí)間:4小時(shí)或6小時(shí)),然后利用免疫熒光染色評(píng)價(jià)神經(jīng)元自噬水平。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,利用經(jīng)顱超聲(中心頻率:0.5 MHz,脈沖重復(fù)頻率:500 Hz,占空比:5%,聲壓:0.42 MPa,超聲強(qiáng)度ISPTA:360mW/cm2,刺激1秒,暫停1秒)對(duì)7月齡小鼠(對(duì)照組:n=14,超聲組:n= 14)刺激4小時(shí),取小鼠皮層與海馬組織應(yīng)用于蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)LC3B與p62蛋白(自噬標(biāo)志物)。結(jié)果:細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,利用強(qiáng)度ISPTA為70 mW/cm2超聲對(duì)原代神經(jīng)元進(jìn)行4小時(shí)或6小時(shí)刺激時(shí),細(xì)胞自噬水平被顯著性提高(對(duì)照組:1.00 ± 0.12,4小時(shí)超聲組:1.37 ± 0.02,6小時(shí)超聲組:1.50 ±0.03,p0.01)。利用強(qiáng)度ISPTA為70 mW/cm2或165 mW/cm2超聲對(duì)原代神經(jīng)元進(jìn)行4小時(shí)刺激時(shí),細(xì)胞自噬水平顯著性提高(對(duì)照組:1.00 ± 0.08,70 mW/cm2超聲組:1.45 ±0.08,165 mW/cm2超聲組:1.61 ±0.02,p 0.01)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)顱超聲輻射力刺激顯著提高小鼠皮層區(qū)的LC3BⅡ/LC3BⅠ比例(對(duì)照組:1± 0.27,超聲組:1.40 ±0.28,p 0.05)。另外,p62 與 LC3B 密切相關(guān),隨著自噬的提高p62蛋白會(huì)被特異性地降解。經(jīng)顱超聲輻射力刺激顯著降低了小鼠皮層區(qū)p62蛋白的表達(dá)(對(duì)照組:1±0.13,超聲組:0.79±0.07,p0.01)。在海馬組織檢測(cè)中,實(shí)驗(yàn)取得相似結(jié)果,經(jīng)顱超聲輻射力刺激顯著性提高 LC3BⅡ/LC3BⅠ 比例(對(duì)照組:1± 0.17,超聲組:1.30 ±0.27,p0.05),并降低p62蛋白表達(dá)(對(duì)照組:1± 0.13,超聲組:0.82 ±0.09,p0.05)。結(jié)論:經(jīng)顱超聲輻射力刺激是一種調(diào)控神經(jīng)元自噬水平的可行之法。綜上所述,本論文明確了經(jīng)顱超聲輻射力刺激對(duì)神經(jīng)元突觸可塑性、初級(jí)纖毛、與自噬的生物效應(yīng),為超聲輻射力神經(jīng)調(diào)控提供新證據(jù),為超聲輻射力神經(jīng)調(diào)控技術(shù)應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的治療奠定理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R741.05
【圖文】：

ＨＰ８Ｂ逡逑０ＨＨ逡逑圖１．２基于ＭＲＩ的無(wú)框架立體定向神經(jīng)導(dǎo)航技術(shù)的經(jīng)顱磁刺激（Ｖａｌｅｒｏ－Ｃａｂｒｅ，邋２０１７）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋Ｔｒａｎｓｃｒａｎｉａｌ邋ｍａｇｎｅｔｉｃ邋ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋ＭＲＩ－ｂａｓｅｄ邋Ｆｒａｍｅｌｅｓｓ邋ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ逡逑ｎｅｕｒｏｎａｖｉｇａｔｉｏｎ邋ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．逡逑４逡逑

逑ＰＴ？Ｉ逡逑ｆｃｌＬ邋ｉｊｆｌｌ邋＾逡逑圖１．１電極深部腦刺激（Ｌｅｗｉｓ，邋２０１６）逡逑（ａ）磁共振成像顯示雙側(cè)深部腦刺激電極；（ｂ）胸部Ｘ光顯示皮下植入刺激器逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｄｅｅｐ邋Ｂｒａｉｎ邋Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ逡逑（ａ）邋Ｍａｇｎｅｔｉｃ邋ｒｅｓｏｎａｎｃｅ邋ｉｍａｇｉｎｇ邋ｓｈｏｗｉｎｇ邋ｂｉｌａｔｅｒａｌ邋ｄｅｅｐ－ｂｒａｉｎ邋ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ邋ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ；邋（ｂ）逡逑Ｃｈｅｓｔ邋ｒａｄｉｏｇｒａｐｈ邋ｓｈｏｗｉｎｇ邋ｔｈｅ邋ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ邋ｉｍｐｌａｎｔｅｄ邋ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ邋ｈａｒｄｗａｒｅ．逡逑１．１．３．２邋經(jīng)頗磁刺激（Ｔｒａｎｓｃｒａｎｉａｌ邋Ｍａｇｎｅｔｉｃ邋Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ〉逡逑Ｂａｒｋｅｒ等（１９８５）第一次報(bào)道了基于法拉第電磁感應(yīng)基本原理的無(wú)創(chuàng)經(jīng)顱磁逡逑刺激技術(shù)，他們發(fā)現(xiàn)該技術(shù)能實(shí)現(xiàn)對(duì)人腦皮層神經(jīng)刺激。該技術(shù)的主要工作原理逡逑是：將磁性線圈置于頭部表面，通過(guò)改變線圈電流，從而形成高強(qiáng)度的脈沖磁場(chǎng)。逡逑該脈沖磁場(chǎng)具備足夠穿透顱骨的能力，并作用于大腦皮層。經(jīng)顱磁刺激能夠影響逡逑皮層區(qū)神經(jīng)細(xì)胞膜電位變化，形成相應(yīng)的感應(yīng)電流，產(chǎn)生各種神經(jīng)生物學(xué)效應(yīng)，逡逑實(shí)現(xiàn)神經(jīng)調(diào)控作用（Ｖａｌｅｒｏ－Ｃａｂｒｅ，２０１７）。研究表明，經(jīng)顱磁刺激具備干預(yù)與治療逡逑抑郁癥、成癮治療、精神分裂癥的潛能。然而，該技術(shù)在刺激深度與刺激空間分逡逑辨率上存在不足。逡逑ＨＰ８Ｂ逡逑０ＨＨ逡逑圖１．２基于ＭＲＩ的無(wú)框架立體定向神經(jīng)導(dǎo)航技術(shù)的經(jīng)顱磁刺激（Ｖａｌｅｒｏ－Ｃａｂｒｅ

逑ＰＴ？Ｉ逡逑ｆｃｌＬ邋ｉｊｆｌｌ邋＾逡逑圖１．１電極深部腦刺激（Ｌｅｗｉｓ，邋２０１６）逡逑（ａ）磁共振成像顯示雙側(cè)深部腦刺激電極；（ｂ）胸部Ｘ光顯示皮下植入刺激器逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｄｅｅｐ邋Ｂｒａｉｎ邋Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ逡逑（ａ）邋Ｍａｇｎｅｔｉｃ邋ｒｅｓｏｎａｎｃｅ邋ｉｍａｇｉｎｇ邋ｓｈｏｗｉｎｇ邋ｂｉｌａｔｅｒａｌ邋ｄｅｅｐ－ｂｒａｉｎ邋ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ邋ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ；邋（ｂ）逡逑Ｃｈｅｓｔ邋ｒａｄｉｏｇｒａｐｈ邋ｓｈｏｗｉｎｇ邋ｔｈｅ邋ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ邋ｉｍｐｌａｎｔｅｄ邋ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ邋ｈａｒｄｗａｒｅ．逡逑１．１．３．２邋經(jīng)頗磁刺激（Ｔｒａｎｓｃｒａｎｉａｌ邋Ｍａｇｎｅｔｉｃ邋Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ〉逡逑Ｂａｒｋｅｒ等（１９８５）第一次報(bào)道了基于法拉第電磁感應(yīng)基本原理的無(wú)創(chuàng)經(jīng)顱磁逡逑刺激技術(shù)，他們發(fā)現(xiàn)該技術(shù)能實(shí)現(xiàn)對(duì)人腦皮層神經(jīng)刺激。該技術(shù)的主要工作原理逡逑是：將磁性線圈置于頭部表面，通過(guò)改變線圈電流，從而形成高強(qiáng)度的脈沖磁場(chǎng)。逡逑該脈沖磁場(chǎng)具備足夠穿透顱骨的能力，并作用于大腦皮層。經(jīng)顱磁刺激能夠影響逡逑皮層區(qū)神經(jīng)細(xì)胞膜電位變化，形成相應(yīng)的感應(yīng)電流，產(chǎn)生各種神經(jīng)生物學(xué)效應(yīng)，逡逑實(shí)現(xiàn)神經(jīng)調(diào)控作用（Ｖａｌｅｒｏ－Ｃａｂｒｅ，２０１７）。研究表明，經(jīng)顱磁刺激具備干預(yù)與治療逡逑抑郁癥、成癮治療、精神分裂癥的潛能。然而，該技術(shù)在刺激深度與刺激空間分逡逑辨率上存在不足。逡逑ＨＰ８Ｂ逡逑０ＨＨ逡逑圖１．２基于ＭＲＩ的無(wú)框架立體定向神經(jīng)導(dǎo)航技術(shù)的經(jīng)顱磁刺激（Ｖａｌｅｒｏ－Ｃａｂｒｅ

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本文編號(hào)：2793375